AntiCVB - Evaluation de nouvelles stratégies antivirales par action sur la protéase 2A ou sur la 3D Polymérase des virus Coxsackie B dans un modèle de culture de cardiomyocytes humains matures issus d'iPSC

par Paul-antoine Gretteau

Projet de thèse en Médecine - STS

Sous la direction de Laurent Andreoletti.

Thèses en préparation à Reims , dans le cadre de Ecole Doctorale Sciences, Technologies, Santé , en partenariat avec (Cardiovir) EA Virologie EPCH Etude des caractères génétiques et Phénotypiques des entérovirus responsables de pathologies Cardiaques Humaines aigues et chroniques (laboratoire) depuis le 09-09-2015 .


  • Résumé

    Contexte : Les entérovirus à tropisme cardiaque sont considérés comme une des principales causes infectieuses des myocardites de l'enfant et de l'adulte jeune. La cardiomyopathie dilatée (CMD; 7 cas /100 000 habitants) en est l'évolution naturelle dans 10% des cas. Il n'existe à ce jour aucun traitement spécifique des CMD d'origine virale permettant d'empêcher l'évolution vers l'insuffisance cardiaque terminale (cause majeure de transplantation cardiaque en Europe) ou la mort subite par troubles du rythme ventriculaire (11 à 19% des cas). Les mécanismes moléculaires par lesquels les enterovirus et notamment le virus « Coxsackie » du groupe B (CVB), petits virus à ARN monobrin génomiques (ARN+), sont capables de générer le phénotype chronique de CMD restent peu connus limitant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Hypothèse de travail : Des formes virales cardiaques génétiquement tronquées ont été mises en évidence au Japon en 2008, puis par notre groupe (EA4684, Cardiovir) en 2014 (publication accepté en cours de publication). Ces formes tronquées ont été découvertes dans des échantillons cliniques avec un ratio 19/1 par rapport à la forme virale complète. Par des évènements de recombinaison entre la forme sauvage et les formes délétées cette proportion permettrait une réplication chronique du virus à faible niveau, expliquant le passage au stade de CMD par une expression de la protéase 2A virale responsable du clivage de la dystrophine. L'utilisation de molécules ayant une action sur la protéase 2A ou la 3D polymérase (indispensable à la réplication des CVB) pourrait limiter la dynamique de recombinaison, de réplication virale et ses conséquences sur la fonctionnalité cellulaire limitant ainsi l'évolution clinique vers le stade de CMD. L'objectif du projet dans un premier temps consistera de détecter in vitro la présence d'évènements de recombinaison entre les formes délétées et sauvage du CVB, d'évaluer la robustesse et la pathogénicité dans un modèle in vivo murin de ces nouvelles formes virales. De nouvelles molécules antivirales par action sur la protéase 2A ou sur la 3D Polymérase des CVB sauvages ou tronqués seront testées dans un modèle de culture de cardiomyocytes humains primaires. Schéma expérimental : Des cellules primaires de cardiomyocytes humains seront co-infectées par des souches de CVB de type 3 sauvages (Wild type) ou tronquées en 5 ‘NC (clones moléculaires : delta 15, 19, 26, 35 et 50 déjà construits et autorisant la synthèse d'ARN+ infectieux) issues de patients atteints de CMD au stade terminal (greffe cardiaque). Les recombinants seront purifiés et la localisation des sites de recombinaisons préférentielles sera déterminée par une approche de séquençage NGS. Une évaluation de la stabilité virale sera effectuée par passage sériques et la fitness des virus recombinants sera déterminée par des tests de compétition. Dans une approche in vivo, la pathogénicité des virus recombinants sera étudiée sur modèle murin (DBA/2J) par évaluation de la morbidité. Des molécules antivirales seront ensuite testées sur ce modèle cellulaire pour explorer deux stratégies antivirales : L'inhibition spécifique de la protéase 2A à l'aide du nouveau peptide « LVLQTM » et par ailleurs l'augmentation du taux d'erreur de la 3D Polymérase virale par la ribavirine, le 5-FU et l'amiloride qui sont susceptibles d‘induire des mutations dites « catastrophes ». La viabilité cellulaire (réduction du resazurin), la capacité de réplication virale (quantités des ARN+ viraux en RT-qPCR). L'indice de mutagénèse du génome viral induit par les molécules testées sera également déterminé après l'utilisation d'approche de séquençage de type NGS (Next generation sequencing). Résultats attendus et perspectives : Les résultats obtenus seront d'un intérêt majeur pour la compréhension des mécanismes de passage vers la chronicité virale. De même, les résultats de cette étude pourront permettre le développement de futures stratégies antivirales contre les infections persistantes par les virus à ARN+ (Enterovirus et virus de l'hépatite C) ; nos données permettront de valider l'utilisation potentielle de futures stratégies thérapeutiques pour lutter contre les infections chroniques humaines par des virus à ARN. Les molécules antivirales présentant les meilleurs résultats seront ensuite testées sur le modèle murin de CMD à CVB au sein de l'équipe EA4684 Cardiovir. Conclusions et retombées : Ce projet pourrait déboucher sur des brevets et applications industrielles potentielles concernant de nouvelles stratégies de traitements des infections humaines aiguës et chroniques par les virus à ARN+.

  • Titre traduit

    AntiCVB - Evaluation of new antiviral strategies by acting on the protease 2A or polymerase 3D of Coxsackie virus B in a culture model of mature cardiomyocytes derived from human iPSC


  • Résumé

    Context: Cardiac tropism enteroviruses are considered one of the leading infectious causes of childhood and young adult myocarditis. Dilated cardiomyopathy (DCM; 7 cases / 100 000 inhabitants) is the natural evolution in 10% of cases. Nowadays there is no specific treatment for viral DCM which may prevent progression to end-stage heart failure (major cause of heart transplantation in Europe) or sudden death by ventricular arrhythmias (11 to 19% of cases). The molecular mecanisms by which enteroviruses including Coxsackievirus type B (CVB), small single stranded genomic RNA viruses (positive RNA), are able to generate a chronic DCM phenotype and remain little known , limiting the development of new therapeutic strategies. Working hypothesis: Genetically truncated cardiac viral forms have been identified in Japan in 2008, followed by our group (EA4684 - cardiovir) in 2014 (publication accepted being published). These deleted forms were discovered in clinical samples with a 19/1 ratio in comparison to full length viral form. By recombination events between the wild type and deleted forms, this proportion would allow chronic replication of low-level virus, explaining the transition to DCM stage by an expression of the viral 2Aprotease responsible of dystrophin cleavage. The use of molecules that act on the 2Aprotease or 3Dpolymerase (essential for CVB replication) could limit the viral recombination & replication dynamics. Its impact on cell function could limit the clinical progression to DCM stage. The project will consist of detecting in vitro, the presence of recombination events between the deleted and the full length forms of the CVB, to assess the toughness and the pathogenicity in vivo of the new viral form. New antiviral molecules which act on the 2Aprotease or the 3Dpolymerase of wild type or truncated CVB will be tested in a culture model of primary human cardiomyocytes. Experimental design: Primary human cardiomyocytes cells are co-infected with several strains of CVB type 3 : Wild type or 5'UTR truncated (molecular clones : delta 15, 19, 26, 35, 50 and 100 already built and authorizing infectious RNA+ synthesis). Recombinant will be purified and the preferential recombination locations will be determined by NGS sequencing approach. Viral stability of recombinant viruses will be performed by serial passage and the fitness will be determined by competitive assay. With in vivo approach, the pathogenicity of the recombinant viruses will be studied on murine model (DBA/2J) by assessing the morbidness. Antiviral molecules will be then tested on the cellular model to explore two antiviral strategies : specific inhibition of the 2Aprotease with the new peptide “LVLQTM” and otherwise increasing the error rate of the viral 3Dpolymerase with ribavirin, 5-FU and amiloride which may induce mutations called “disaster”. Cell viability (resazurin reduction), viral replication capacity (Quantity of viral RNA+ by RTqPCR) will be tested. The mutagenesis index of the viral genome will also be determined by using NGS type approach. Expected results & outlook: The results will be of great interest for understanding the transition mechanism into viral chronicity. Similarly, the results of this study will enable the development of future antiviral strategies against persistent infection by RNA+ viruses (Enteroviruses & Hepatitis C); our data will validate the potential use of future therapeutic strategies against human chronic infections by RNA viruses. The antiviral molecules with the best results will be tested in mouse model of CVB DCM within the EA4684 – cardiovir team. Conclusions & benefits: This project could lead to patents and potential industrial applications for new treatment strategies for acute and chronic human infections by RNA+ viruses.