Evaluation pré-clinique du bénéfice de la supplémentation par l'hémoglobine extra-cellulaire d'Arenicola marina au cours de la préservation des greffons hépatiques

par Carlos Castro Benitez

Projet de thèse en Toxicologie

Sous la direction de René Adam et de Francis Levi.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Inserm U 935 - Modèles de cellules souches malignes et thérapeutiques (laboratoire) , Chronothérapie des cancers du foie et optimisation des fonctions hépatiques après chirurgie (equipe de recherche) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-11-2013 .


  • Résumé

    Le malade atteint d'une maladie du foie nécessite une prise en charge par une équipe multidisciplinaire médico-chirurgicale et oncologique ayant à sa disposition l'ensemble des moyens diagnostiques et thérapeutiques pour assurer sur un seul site la prise en charge globale du malade. Créé en 1993, le CHB est organisé en « Institut des Maladies du Foie » et permet cette organisation. La transplantation en son sein est un axe prioritaire : il est le premier centre de transplantation hépatique français, le 3ième à l'échelon européen avec à ce jour plus de 3000 greffes hépatiques réalisées et une activité de greffe annuelle de 120 à 140 transplantations. Centre de référence national et international, il coordonne le registre européen de transplantation hépatique (ELTR) qui évalue les données de plus de 100.000 greffes réalisées dans 147 centres et 25 pays. La transplantation hépatique est aujourd'hui le traitement reconnu des maladies aigues ou chroniques et en particulier dans le cadre des cancers primaires et secondaires du foie lorsque la maladie menacent le pronostic vital (10). Elle a connu au cours des vingt dernières années une évolution exponentielle, mais atteint maintenant un plateau d'environ 6000 greffes par an en Europe dont environ 1100 en France. Ce plateau s'explique par la pénurie de donneurs au regard du nombre de patients en attente de transplantation. De ce fait, les greffons dits « marginaux » (donneurs âgés, foies stéatosiques, foies issus de donneurs à cœur arrêté, etc…) sont de plus en plus largement utilisés pour limiter la pénurie d'organes et le risque de décès des malades en liste d'attente. La contrepartie de cette attitude est pour ces greffons « marginaux » un risque plus important de non-fonction primaire du greffon ou de dysfonctionnement précoce après la transplantation, risques qui peuvent menacer la vie du patient et/ou conduire à une retransplantation. C'est dans ce contexte que la préservation hépatique, qui a fait des progrès considérables avec la découverte de la solution UW dans les années 90 (1) est remise en exergue actuellement dans une exigence de qualité optimale pour limiter les risques plus importants de ces greffons marginaux. Ainsi, des solutions de conservation alternatives à l'UW ont été développées et sont actuellement utilisées dans plus de 50% des transplantations réalisées en Europe (Adam et Coll, Communication at the European Society of Organ Transplantation, Vienna 2013) avec pour certaines des résultats au moins équivalents à l'UW. Notre équipe possède aujourd'hui expérience clinique et expérimentale de la préservation hépatique (1, 2) (3) (4) (5) (6-8) C'est également dans ce contexte que les machines de perfusion initiées dans la transplantation rénale sont de plus en plus utilisées sur le foie afin d'optimiser la qualité des greffons et limiter les lésions d'ischémie-reperfusion à l'origine de leurs dysfonctionnements après transplantation. (11) (12). L'évaluation de l'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola marina (HEMO2Life) au cours de la préservation de greffons hépatiques est donc tout à fait opportune dans le cadre de cet axe de recherche, compte tenu des résultats prometteurs obtenus en préservation rénale (9). La première étape de mon projet au niveau préclinique, avec la machine de perfusion (Annexes 1,2) et, première à l'échelon national nous a permis de faire notre courbe d'apprentissage, d‘identifier et de surmonter les difficultés techniques de ce type de perfusion. Nos premiers résultats suggèrent que l'évaluation de la fonction de greffons considérés comme « limites » est faisable. Trois des neuf greffons récusés pour stéatose (greffon témoin exclus), soit un tiers des greffons ont présenté un profil de fonction en machine laissant supposer qu'ils auraient pu être utilisés. Cette expérience suggère que la perfusion normothermique de greffons stéatosiques permet d'évaluer la fonction de greffons récusés pour stéatose sévère et pourrait être utilisée ainsi comme un outil de sélection. La deuxième étape au niveau expérimentale chez le rat, vise à démontrer que l'implémentation de l'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola marina au cours de la préservation de greffons hépatiques dans toutes les scenarios possibles (foie normal, stéatose, donneur à cœur arrêté). La diminution de marqueurs de souffrance (ASAT, ALAT, Lactate, DHL, production de bile) au moment de la perfusion ex vivo (Annexe 3), a montré une supériorité par rapport a la conservation statique à 4°C (résultats prémiminaires). A l'heure actuelle je suis en train de finaliser les expériences au laboratoire. L'aboutissement de ce projet permettra potentiellement d'améliorer la fonction du greffon hépatique après transplantation, avec diminution de l'incidence des non-fonctions et des dysfonctions du greffon. Il favorisera la diminution les lésions ischémiques biliaires chez les donneurs à cœur arrêté et améliorera la qualité des greffons considérés traditionnellement comme non transplantables et qui pourraient être secondairement transplantés. Finalement, nous espérons par ce travail augmenter le pool de foies transplantables et diminuer le risque de mort en liste d'attente de transplantation. L'analyse approfondie des mécanismes d'action de la machine de perfusion et de l'hémoglobine extracellulaire sont indispensables pour identifier des cibles thérapeutiques visant à diminuer les effets secondaires de l'ischémie et reperfusion et augmenter la survie des patients greffés.

  • Titre traduit

    Pre-clinical evaluation of the benefit of supplementation by the extracellular hemoglobin Arenicola marina in the preservation of liver grafts


  • Résumé

    The patient with a liver disease requires care by a multidisciplinary medical-surgical and oncological team having at his disposal all the diagnostic and therapeutic means to ensure on a single site the overall care of the patient. Created in 1993, the CHB is organized in "Institute of Liver Diseases" and allows this organization. Transplantation within it is a priority: it is the first center for French liver transplantation, the third largest in Europe, with more than 3,000 liver transplants performed and an annual transplant activity of 120 to 140 transplants. As a national and international reference center, it coordinates the European Hepatic Transplantation Registry (ELTR), which evaluates data from more than 100,000 transplants in 147 centers and 25 countries. Hepatic transplantation is now the recognized treatment of acute or chronic diseases and in particular in primary and secondary cancers of the liver when the disease threatens the vital prognosis (10). During the last twenty years, it has developed exponentially, but now reaches a plateau of about 6000 transplants per year in Europe, of which about 1100 in France. This plateau is explained by the shortage of donors with regard to the number of patients awaiting transplantation. As a result, "marginal" grafts (elderly donors, steatosal livers, livers from stopped heart donors, etc.) are increasingly used to limit organ shortages and the risk of death of patients waiting list. The counterpart of this attitude is for these "marginal" grafts a greater risk of primary non-function of the graft or of early dysfunction after transplantation, risks that may threaten the patient's life and / or lead to re-transplantation. It is in this context that hepatic preservation, which has made considerable progress with the discovery of the UW solution in the 1990s (1), is currently emphasized in an optimal quality requirement in order to limit the greater risks of these Marginal grafts. Thus, alternative conservation solutions to UW have been developed and are currently used in more than 50% of transplants carried out in Europe (Adam et al, Communication at the European Society of Organ Transplantation, Vienna 2013) At least equivalent to the UW. It is also in this context that the perfusion machines initiated in the renal transplantation are increasingly used on the liver to optimize the quality of the grafts and limit the ischemia-reperfusion lesions causing their dysfunctions After transplantation. (11) (12). The evaluation of the extracellular hemoglobin of Arenicola marina (HEMO2Life) during the preservation of hepatic grafts is therefore very timely within the framework of this research axis, given the promising results obtained in renal preservation (9) . The first stage of my project at the preclinical level, with the perfusion machine (Annexes 1, 2) and, first at the national level, allowed us to make our learning curve, to identify and to overcome the technical difficulties of This type of infusion. Our first results suggest that the evaluation of the function of grafts considered as "limits" is feasible. Three of the nine grafts rejected for steatosis (excluding the control graft), or one third of the grafts, presented a machine function profile suggesting that they could have been used. This experiment suggests that the normothermic perfusion of steatotic grafts makes it possible to evaluate the function of grafts rejected for severe steatosis and could thus be used as a selection tool. The second step at the experimental level in rats aims to demonstrate that the implementation of extracellular hemoglobin of Arenicola marina during the preservation of liver grafts in all possible scenarios (normal liver, steatosis, stopped heart donor) . The decrease in pain markers (ASAT, ALAT, Lactate, DHL, bile production) at the time of ex vivo infusion (Appendix 3) showed superiority to static preservation at 4 ° C (preliminary results). At the moment I am in the process of finalizing the experiments in the laboratory. The outcome of this project will potentially improve the function of the hepatic graft after transplantation, with reduced incidence of non-function and graft dysfunction. It will help reduce ischemic biliary lesions in heartbound donors and improve the quality of grafts traditionally considered non-transplantable and which could be transplanted secondarily. Finally, we hope by this work to increase the pool of transplantable livers and decrease the risk of death on the transplant waiting list. A thorough analysis of the mechanisms of action of the perfusion machine and extracellular hemoglobin is essential to identify therapeutic targets to reduce the side effects of ischemia and reperfusion and increase the survival of transplant patients.