Etude de la relation structure-fonction de la protéine subtélomérique Tbf1 de saccharomyces cerevisae

par Wala Messaoud

Projet de thèse en Biochimie et biologie structurale

Sous la direction de Marie-Hélène Ledu.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (2015-.... ; Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine) , en partenariat avec Université Paris-Sud (établissement opérateur d'inscription) depuis le 01-10-2012 .


  • Résumé

    Les télomères sont les structures nucléoprotéiques qui constituent l'extrémité des chromosomes linéaires des eucaryotes et jouent un rôle important dans le maintien de l'intégrité du génome (Giraud-Panis et al, 2013). Leur dysfonctionnement chez l'Homme est associé à l'apparition de cancers ainsi qu'à des pathologies du vieillissement. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l'ADN télomèrique est constitué de répétitions dégénérées du type TG1-3. La protéine Rap1 lie directement la région double brin de ces répétitions pour former l'assemblage télomérique primaire. Au fil des divisions cellulaires les télomères raccourcissent naturellement, et l'ultime barrière protectrice des télomères courts contre les machineries de réparation de l'ADN implique une synergie fonctionnelle entre Rap1 et la protéine sub-télomérique Tbf1 (Fukunaga et al., 2012). La protéine Tbf1 est apparentée aux protéines télomériques TRF1 et TRF2 que l'on retrouve chez les eucaryotes supérieurs et reconnait les séquences d'ADN du type T2AG3, caractéristiques des télomères d'eucaryotes supérieurs ou des régions sub-télomeriques de la levure. Lorsque les télomères raccourcissent, les quelques sites télomériques TG1-3 restants se juxtaposent aux sites sub-telomeriques T2AG3 et les protéines Rap1 et Tbf1 se rapprochent. Par ailleurs, des ilots TG1-3 recouverts de Rap1 sont observés dans les régions sub-télomériques T2AG3. Récemment, il a été montré que Tbf1 contribue d'une part, à la protection des télomères courts contre certains mécanismes de réparation des cassures doubles brins d'ADN (Fukunaga et al ., 2012) et d'autres part, à la régulation négative de l'allongement des télomères longs (Arneric et Lingner, 2007). Les principaux objectifs de mon projet de thèse sont : -D'accéder aux déterminants structuraux associés aux fonctions de Tbf1; - De comprendre l'origine moléculaire de la synergie fonctionnelle observée entre Rap1 et Tbf1. Dans ce but, nous avons délimité les domaines constituants la protéine TBF1 par protéolyse ménagée couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS). La protéine comprend 2 domaines protégés : un domaine dont la masse molaire est d'environ 30 KDa (TBFH) et un autre domaine de taille plus petite (Myb) qui reconnait spécifiquement la séquence TTAGGG d'ADN. L'affinité de l'interaction pour la séquence TTAGGG mesurée avec la protéine intégrale ou le domaine Myb est similaire et de l'ordre de 30nM. Après clonage, production et purification de chacun de ces 2 domaines, nous avons obtenu des cristaux qui diffractent à 2.3 et 2.6Å respectivement pour le complexe Myb-Tbf1/TTAGGG et pour le domaine TBFH. Pour résoudre la structure du complexe Myb-Tbf1/TTAGGG, nous avons commencé par une approche de remplacement molcélulaire avec comme modèle le complexe Myb-TRF2/TTAGGG (18% d'homologie). La résolution de la structure du TBFH sera abordée par phasage expérimental à l'aide de dérivés d'atomes lourds puisque ce domaine ne contient ni homologue structural, ni méthionine.

  • Titre traduit

    A study on the structure-function relationship of the Saccharomyces crevasse 's subtelomeric protein Tbf1


  • Résumé

    Telomeres are nucleo-protein structures that constitute the end of eukoryotes linear chromosomes and are crucial for genome integrity. In human, telomeres dysfunctions are associated to cancers and ageing pathologies. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, telomeric DNA is constituted by degenerated TG1-3 repeats. Rap1 protein directly binds the double strand region of these DNA repeats to form telomere first shell assembly, and interacts with protein partners Rif1, Rif2, Sir3 and Sir4 involved in telomeres protection, and negative regulation of lengthening. Telomeres naturally shorten upon cell divisions, and the ultimate barrier against DNA repair machineries involves a functional synergy between Rap1 and the sub-telomeric protein Tbf1. Tbf1 is related to TRF1 and TRF2 telomeric proteins from higher eukaryotes, and recognizes DNA sequence T2AG3 typical from higher eukaryotes telomeres or yeast sub-telomeric regions. At short telomeres, TG1-3 repeats adjoin sub-telomeric T2AG3 and Rap1 and Tbf1 come closer. It has been recently shown that Tbf1 is involved in: 1/ protection of short telomeres against some double strand break repair mechanisms; 2/ negative regulation of long telomeres lengthening. Our previous studies of Rap1 architecture allowed us building a first shell telomere assembly. On this basis and using similar approaches, we are now seeking at understanding the structural behaviour of Tbf1 upon its interaction with DNA, how it may interact with Rap1, and how telomere shortening could favour these interactions.