Cellules tumorales et leur micro-environnement: développement de modèles 3D in vitro pour l'évaluation préclinique de nouveaux nanomédicaments

par Gianpiero Lazzari

Thèse de doctorat en Pharmacotechnie et biopharmacie

Sous la direction de Patrick Couvreur et de Simona Mura.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Institut Galien Paris-Sud (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement opérateur d'inscription) .


  • Résumé

    Au cours des dernières décennies, des systèmes de taille nanométrique chargés en principes actifs (nanomédicaments) et des nouvelles stratégies thérapeutiques ont été développés afin de surmonter les limitations liées à la chimiothérapie conventionnelle telles qu'une distribution non spécifique, une mauvaise accumulation dans les tissus cibles ainsi qu'une métabolisation rapide. Cependant, le succès des nouveaux médicaments en clinique reste encore limité et seulement un faible nombre de nanomédicaments est actuellement commercialisé. Une divergence entre les résultats précliniques in vitro et les performances obtenues in vivo est souvent observée dans la première étape du développement d'un médicament. Cet écart pourrait être attribué au manque de modèles pertinents, représentatifs de la pathologie observée chez l'Homme et qui soient de bons prédicteurs de la réponse thérapeutique chez les patients. En effet, les modèles utilisés aujourd'hui (généralement culture cellulaire en deux dimensions, 2D) ne reproduisent pas la structure complexe de la tumeur in vivo. Ainsi, ils ne permettent pas une évaluation fiable du potentiel thérapeutique réel des médicaments. Dans cette optique, les méthodologies de culture de cellules en trois dimensions (3D) sont extrêmement avantageuses. Ces méthodologies permettent, en effet, la construction de systèmes cellulaires pertinents qui reproduisent in vitro la relation entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement. Parmi ces modèles, l'assemblage de cellules sous forme de sphéroïdes multicellulaires a été largement exploré. Néanmoins, les sphéroïdes décrits jusqu'à présent correspondent à des nodules formés exclusivement de cellules cancéreuses, ce qui constitue une vraie limitation. En effet, ces sphéroïdes ne reproduisent pas l'organisation de la tumeur et l'hétérogénéité du microenvironnement, et par conséquent ils ne parviennent pas à mimer les multiples barrières biologiques que les médicaments doivent traverser pour atteindre les cellules cibles. Dans cet esprit, l'objectif de cette thèse de doctorat était de surmonter ces limitations et de construire des modèles pertinents qui reproduisent in vitro la relation entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement afin de i) mieux comprendre les mécanismes de passage des nanomédicaments et ii) mieux prédire l'efficacité des nouveaux traitements. Au cours de cette thèse nous nous sommes intéressés au cancer du pancréas qui est caractérisé par la présence d'un abondant stroma formant un bloc fibreux (réaction desmoplastique) qui limite la pénétration des médicaments et réduit ainsi leur efficacité. Cette tumeur représente donc un bon exemple de barrière biologique tumorale. La partie principale de ce travail de recherche repose sur la construction et la caractérisation complète d'un nouveau type de sphéroïde multicellulaire, capable de reproduire in vitro la relation entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement, grâce à la co-culture de cellules cancéreuses pancréatiques, de fibroblastes et de cellules endothéliales. Les études de cytotoxicité in vitro nous ont permis d'investiguer la capacité de ce modèle à reproduire la résistance des cellules cancéreuses aux traitements observés in vivo. Grâce à la Microscopie de Fluorescence à Feuillet de Lumière nous avons pu étudier la pénétration de la doxorubicine, soit en forme libre, soit encapsulée dans des nanoparticules, au sein des sphéroïdes. Ensuite, afin de mieux comprendre comment les médicaments et nanomédicaments interagissent avec la tumeur, nous avons cherché à combiner la culture 3D avec des conditions dynamiques contrôlées dans un dispositif microfluidique. Pour atteindre cet objectif, nous avons conçu et fabriqué une puce sur mesure, adaptée pour loger à la fois le sphéroïde et des canaux dans lesquels les cellules endothéliales pourront s'organiser sous forme de vaisseaux.

  • Titre traduit

    Shedding lights on cancer cells and their microenvironment: development of 3D in vitro tumor models to shorten the translation of nanomedicines from the bench to the bedside


  • Résumé

    In the last decades, various engineered systems for drug delivery (i.e., nanomedicines) have been developed with the aim to overcome the limits associated to conventional chemotherapy, such as non-specific drug distribution, poor delivery to the target tissue and rapid metabolism. However, the success of new therapeutic strategies in the clinic is still suboptimal and only a limited number is currently marketed. A discrepancy between promising preclinical in vitro results and the in vivo performances is often observed in the early stage of drug development and might be ascribed to the lack of capacity of the models commonly used for in vitro studies to faithfully reproduce the pathophysiology of solid tumors. These models mainly consist of cancer cells cultured as flat (two dimensional, 2D) monolayers or assembled to form three dimensional (3D) multicellular tumor spheroids (MCTS). However, being composed exclusively of one cell type, these models are too simplistic. They do not allow to reproduce the heterogeneous cellular composition, as well as, the complex architecture of the tumor and its surrounding microenvironment. Thus, they fail to replicate the multiple biological barriers that drugs and nanomecidines have to cross in order to reach the target cells. The aim of this PhD thesis was to overcome these limitations and construct a reliable tool for an appropriate in vitro evaluation of the therapeutic potential of nanomedicines and other chemotherapies. Attention has been focused on the pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) whose strong fibrotic reaction represents a well-known example of a tumor biological barrier responsible of the limited efficacy of the treatments. The main part of this research work relies on the construction and complete characterization of novel hetero-type MCTS based on a triple co-culture of pancreatic cancer cells, fibroblasts and endothelial cells, and thus capable to integrate the cancerous component and the microenvironment of the tumor. The constructed 3D model has demonstrated the capacity to reproduce in vitro the influence of the microenvironment on the sensitivity of cancer cells to chemotherapy. In addition, by combining the 3D model and the innovative Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM), we have been able to investigate the penetration of the anticancer drug doxorubicin (in a free form and loaded into nanoparticles (NPs)) in a high informative manner. Then, in order to acquire a better understanding on how nanomedicines and other anticancer chemotherapies interact with the tumor, we sought to combine the hetero-type 3D culture with controlled flow conditions in a microfluidic device. To reach this goal we have designed and fabricated a tailor-made chip suitable to host both a MCTS and a perfusable microvascular network (i.e., MCTS-on-a-chip).