Caractérisation structurale du recrutement de JIP3 par la kinésine-1

par Fernando Vilela

Projet de thèse en Biochimie et biologie structurale

Sous la direction de Julie Menetrey.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (I2BC) (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    Les Kinésines sont des moteurs moléculaires capables de transporter de nombreux et variés cargos le long du cytosquelette de microtubule ; ce sont des mécano-enzymes qui génèrent une force mécanique à partir de l'énergie chimique produite par l'hydrolyse de l'ATP. Leur dysfonctionnement au niveau du transport intracellulaire est associé à plusieurs pathologies, incluant des maladies neuro-dégénératives, le cancer, des défauts du développement et un groupe de maladies appelées les ciliopathies. De nombreuses études biochimiques et structurales ont permis de comprendre comment ces moteurs moléculaires générent une force mécanique le long des microtubules. Cependant, peu d'étude biochimique et structurale ont été menées pour comprendre comment ils reconnaissent et recrutent leur différents cargos et commment ils sont activés par ces même cargos. La kinésine-1 est un excellent modèle d'étude pour aborder ces différentes questions puisque la compréhension de la motilité des kinésines vient majoritairement de l'étude de la kinésine-1. Le but de ce projet de doctorat est de mener la caractérisation structurale de l'interaction entre la kinésine-1 et l'un de ses cargos, la protéine JIP3. JIP3 a été initialement identifiée comme une protéine d'échafaudage pour les cascades des MAP kinases, JNK et P38 jouant un rôle de régulation dans ces voies de signalisation essentielles (Kelkar, 2000 ; Ito, 1999). JIP3 a aussi été identifiée comme une protéine adaptatrice/cargo pour deux moteurs moléculaires associés aux microtubules, le complexe dynéine/dynactine et la kinésine-1 régulant le transport neuronal (Bowman, 2000). La kinésine-1 recrute JIP3 via deux sites de fixation distincts : (i) la chaîne légère, KLC (Bowman, 2000) et (ii) la queue intrinsèquement dépliée de la chaîne lourde (KHC) (Sun, 2011). Au laboratoire, nous avons précédemment étudié l'interaction entre JIP3 et KLC au niveau moléculaire par des approches structurales et biophysiques (Llinas et al., en préparation). Aujourd'hui, nous proposons d'étudier l'interaction entre JIP3 et la queue de KHC. La kinésine-1 et JIP3 seront produites en système bactérien et purifiées à homogénéité. La caractérisation du complexe Kin1_KHC:JIP3 sera menée en solution par différentes approches biophysiques telles que l'ITC, MALS, AUC, MST, RMN, et le SAXS, ainsi que par des approches de biologie structurale, principalement par cristallographie pour visualiser à haute résolution l'interface du complexe. Ces études apporteront des informations critiques pour décrire et comprendre comment Kin1_KHC reconnait et fixe JIP3, et comment la kinésine-1 recrute un cargo par un double mode d'interaction. De plus, ces données seront intéressantes pour comprendre le rôle de JIP3 au niveau de l'activation de la kinésine-1. Pour aborder la fonction de cette interaction, nous allons étroitement collaborer avec Kristen Verhey (Université du Michigan, USA) and Philippe Chavrier (Institut Curie, Paris) qui sont des biologistes cellulaires experts dans ces domaines. Ainsi, notre but final est de détailler le rôle de ces interactions au niveau (i) du transport neuronal et les maladies associées et (ii) des cascades des MAP kinases dont le dysfonctionnement peut conduire à des processus cancéreux.

  • Titre traduit

    Structural characterization of JIP3 recruitment by Kinesin-1


  • Résumé

    Kinesin motors utilize the energy of ATP hydrolysis to transport organelles, membrane vesicles and protein complexes along the microtubule cytoskeleton in order to organize cellular components for proper cell morphology and function. Defects in kinesin-dependent transport are associated with many diseases, including neuro-degeneration, cancer, developmental defects and a group of diseases termed the ciliopathies. Extensive advances have been made in our understanding of the structure and mechanics of the catalytic motor domain. However, less is known about how kinesins recognize and bind to the proper cargo, become activated for transport, and deliver/release that cargo to the correct cellular location. Kinesin-1 represents an excellent paradigm to address the above questions since most of our understanding of kinesin mechanics comes from work on kinesin-1. The aim of this PhD project is to provide a structural characterization of the interaction between kinesin-1 and one of its cargos, JIP3. JIP3 was initially identified as scaffold proteins for the MAP kinase cascades, JNK and p38 playing regulatory roles in these critical signalling pathways (Kelkar, 2000 ; Ito, 1999). JIP3 was also identified as adaptor/cargo proteins for two microtubule-based molecular motors, the dynein/dynactin complex and kinesin-1 regulating neuronal transport (Bowman, 2000; Kelkar, 2005). Kinesin-1 recruits JIP3 through a dual mode of binding, through its light chain, KLC (Bowman, 2000; Nguyen, 2005) and through the intrinsically unfolded tail region of its heavy chain (KHC) (Sun, 2011). In the laboratory, we have investigated the interaction between Kin1_KLC and JIP3 at the molecular level using structural and biophysical approaches (Llinas et al., in preparation). Now, we propose to characterize at the molecular level the JIP3 recruitment by Kin1_KHC. Both kinesin-1 and JIP3 proteins will be produced in bacteria and purify to homogeneity. The characterization of the Kin1_KHC:JIP3 complexes will be performed in solution using different biophysical approaches such as ITC, MALS, AUC, MST, NMR and SAXS and they will be studied by X-ray crystallography in order to visualize at high resolution the interface of the complex. Overall, these studies will bring critical information on how Kin1_KHC recognizes and binds to JIP3 and how kinesin-1 recruit a cargo in a dual mode of binding. In addition, these data will be interesting for the analysis of the role of JIP3 in the activation of kinesin-1. In order to understand what is the biological meaning of this dual mode of recruitment, we will work in close interaction with our collaborators Kristen Verhey (University of Michigan, USA) and Philippe Chavrier (Curie Institut, Paris) who are cellular biologist experts in this field. Thus, our final goal is to detail the functional relevances of these interactions in (i) neuronal transport and associated diseases and (ii) in MAP kinase cascades, and their dysfunction that can lead to cancer.