Modification intracellulaire des protéines par réaction de Suzuki-Miyaura

par Arnaud Peramo

Projet de thèse en Pharmacotechnie et biopharmacie

Sous la direction de Patrick Couvreur et de Didier Desmaële.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Institut Galien Paris-Sud (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    Modification intracellulaire des protéines par réaction de Suzuki-Miyaura Directeurs de Thèse : Patrick Couvreur, Didier Desmaële Résumé Ce projet a pour but de développer une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à utiliser des nanoparticules, non plus pour transporter un médicament vers sa cible, mais pour manipuler une protéine d'intérêt au niveau cellulaire. Nous nous proposons de développer des nanoparticules de palladium dotées d'une capacité catalytique afin de modifier in vivo par une réaction de Suzuki-Miyaura des protéines intracellulaires à des fins thérapeutiques. Pour faire la preuve de concept de la méthode nous envisageons de modifier ex vivo et in vivo la thyroglobuline, une protéine naturelle halogénée, impliquée dans la maladie de Graves et dans certains cancers de la thyroïde. La thyroglobuline sera couplée par réaction de Suzuki à un marqueur de polyubiquitination ce qui devrait la désigner comme substrat pour une protéolyse par le protéasome 26S. Etat de l'art La fonctionnalisation sélective de macromolécules biologiques à l'intérieur de la cellule est un outil puissant pour disséquer et modifier les processus cellulaires.1 Typiquement, la machinerie biosynthétique de la cellule est utilisée pour incorporer un tag sur la biomolécule cible. Une sonde exogène est ensuite administrée de manière à réagir de manière chimiosélective avec la protéine modifiée. Des acides aminés non naturels, fonctionnalisés par groupements alcyne, azoture, alcène, et halogénure d'aryle peuvent être insérés dans les protéines.2-4 Le principal obstacle est de trouver une réaction pouvant être effectuée dans des conditions physiologiques, en utilisant des réactifs non-toxiques, pouvant traverser les membranes, et inertes avec les myriades d'autres groupes fonctionnels présents in vivo. Seule une poignée de réactions satisfait à ces critères, telles la cycloaddition d'Huisgen, la ligature de Staudinger, la réaction de Diels-Alder à demande inverse, les réactions 'photo-click' et la réaction de Sonogashira. Parmi les réactions de formation de liaison carbone-carbone catalysées par le palladium la réaction de Suzuki-Miyaura semble particulièrement adaptée aux applications cellulaires. Elle implique le couplage d'un halogénure d'aryle (bromure et iodure principalement) avec un acide arylboronique ou un ester boronique, en présence d'un catalyseur de palladium (0). La faible toxicité du palladium aux concentrations nécessaires, la solubilité des acides boroniques dans l'eau ainsi que la possibilité d'effectuer un marquage par un fluorophore rendent cette approche très attrayante pour l'étiquetage des protéines dans les cellules vivantes.5 Récemment, une protéine génétiquement modifiée par l'insertion d'un résidu 4-iodophénylalanine a été engagée dans une réaction de Suzuki-Miyaura en utilisant un catalyseur au palladium in vitro et à la surface de bactéries.6-8 D'une manière remarquable, aucune toxicité du catalyseur au palladium n'a été observée. Plus récemment, le premier exemple d'une réaction catalysée au palladium dans une cellule de mammifère a été décrit, à l'aide de palladium(0) déposé sur des billes de polystyrène.9 Bien que ce système n'implique pas de biomolécules, il démontre la faisabilité de la fonctionnalisation sélective de protéines par une chimie in vivo. Plan de travail Les complexes du palladium généralement utilisés pour le couplage de Suzuki-Miyaura des biomolécules, reposent sur des ligands qui souffrent d'une mauvaise perméabilité cellulaire et ont une forte tendance à se fixer sur les protéines et les thiols endogènes.7 Pour résoudre ce problème, nous utiliserons des nanoparticules de palladium stabilisées par un polymère. A titre d'exemple, des nanoparticules de palladium-polyéthylène glycol ont été décrites comme des catalyseurs efficaces dans la réaction de Suzuki-Miyaura 10-17 Par leur taille ces particules présentent d'intéressantes propriétés de pénétration cellulaire.18,19 Ce type de nanoparticules peut donc fournir des catalyseurs très efficaces pour la modification spécifique des protéines par couplage croisé de Suzuki-Miyaura à l'intérieur de la cellule (Figure 1). Figure 1: Marquage intracellulaire de protéines iodées par couplage de Suzuki-Miyaura impliquant des) nanoparticules de palladium (0) et un acide borique portant un marqueur fluorescent (représenté par l'étoile rouge) Les halogénures d'aryles nécessaires à la réaction de Suzuki-Miyaura ne sont pas habituellement présents dans le vivant à l'exception d'une protéine iodée, la thyroglobuline. Chez les mammifères, la thyroglobuline est exprimée dans les cellules folliculaires et est transportée vers la lumière de la vésicule où les résidus tyrosine sont iodés et couplés pour former les protéines T3 et T4. La thyroglobuline iodée est ensuite réabsorbée par les cellules folliculaires où elle est dégradée par le lysosome pour libérer T3 et T4 qui sont ensuite envoyées vers le flux sanguin.20 La dérégulation des taux d'hormones thyroïdiennes peut conduire à des pathologies graves. Par exemple, leur surabondance peut conduire à la maladie de Graves, une maladie auto-immune affectant 2% des Femmes et 0,2% des Hommes.21 Une stratégie intéressante pour contrôler les niveaux de protéines intracellulaires serait d'y ajouter sélectivement un tag pour la désigner à la dégradation par protéolyse en utilisant la machinerie cellulaire.22 Modifier une protéine cible pour qu'elle soit reconnue par la ligase E3 peut promouvoir sa polyubiquitination et sa dégradation ultérieure. Ce concept est utilisé dans la technologie PROTACS (Proteolysis Targeting Chimeric Molecules).22–25 Cette technique prometteuse a permis de réduire l'expression de plusieurs protéines cible possédant un intérêt thérapeutique sans recourir à une modification génétique.26,27 D'une manière analogue, les groupements iodés de la thyroglobuline pourraient être exploités pour fixer par liaison covalente via une réaction de Suzuki-Miyaura un agent de recrutement de la ligase E3, ce processus étant catalysé par des nanoparticules de Pd(0). Cela permettrait un contrôle spécifique des niveaux d'expression des protéines,entraînant finalement une diminution des taux sanguins d'enzymes thyroïdiennes. Nous nous proposons donc : 1. De développer et optimiser des nanoparticules de Pd(0) - Des nanoparticules de palladium seront synthétisées dans l'eau en présence de divers polymères comme agents de stabilisation en s'inspirant des procédures déjà publiées.10-13,15-17,28 Le rapport Pd: polymère sera optimisé afin d'obtenir des nanoparticules ayant des diamètres allant de 1,5 à 20 nm. La nature du polymère, le temps de réaction, la source de palladium, la taille du polymère, le rapport Pd/polymère seront modifiés afin d'optimiser les propriétés du catalyseur. L'activité catalytique, la pénétration cellulaire et la cytoxicité des particules résultantes seront déterminés en vue de sélectionner les meilleures formulations. 2. D'étudier la réaction de Suzuki-Miyaura intracellulaire de la thyroglobuline iodée dans les cellules FRTL-5 de thyroïde de Rat Fisher Pour faire la preuve de concept de cette approche, la réaction de couplage sera tentée dans des cellules de Rat Fisher (FRTL-5), une lignée exprimant naturellement la thyroglobuline iodée.29 Un criblage des conditions de réaction sera effectué par l'étude du couplage de la thyroglobuline intracellulaire iodée avec un acide boronique modèle. La mise au point d'un dérivé d'acide boronique fluorescent perméable permettra un criblage à haut débit des conditions de la réaction. Des paramètres tels que la nature du catalyseur, la quantité d'acide boronique, la concentration des réactifs, le temps de réaction seront optimisés. La spécificité et la bio-orthogonalité des réactions de marquage seront évaluées en utilisant des expériences de contrôle contenant des lysats cellulaires. 3. De synthétiser des acides boroniques fonctionnalisés par un marqueur de protéolyse et les évaluer dans leur capacité à induire la dégradation de la thyroglobuline intracellulaire par le protéasome 26S Plusieurs peptides ou petites molécules ont été décrits comme capables de reconnaitre des domaines de la ligase E3 et d'induire le mécanisme d'ubiquitination et la promotion de la dégradation de la protéine cible. En particulier, des imidazolines appelés nutlines se sont révélées capables de favoriser une interaction sélective entre un récepteur des androgènes cible et la ligase E3, conduisant à sa dégradation.30 Une nutline de ce type sera donc utilisée en priorité pour élaborer un acide boronique utilisable comme signal de protéolyse. 4. De faire la preuve de concept in vivo par injection dans la thyroïde de rat La preuve de concept concernant l'efficacité de notre approche sera réalisée in vivo par la co-injection de l'acide boronique portant le marqueur de protéolyse avec les nanoparticules de palladium dans la glande thyroïde de rat. Conclusion Dans la dernière décennie, l'étiquetage de protéine spécifique in vivo a permis une révolution de notre compréhension des processus biologiques et révélé de nouveaux moyens pour traiter les maladies. Comparé à d'autres réactions bio-orthogonales couramment employées, le couplage de Suzuki-Miyaura présente des avantages significatifs en termes de sélectivité et d'absence de toxicité. Il a démontré son efficacité pour la fonctionnalisation rapide et dans des conditions douces de protéines in vitro et à la surface des bactéries. Par conséquent, il doit permettre le développement d'une méthode spécifique de marquage de protéines dans les systèmes vivants. Le développement de conditions de réaction efficaces pour effectuer un marquage bio-orthogonal de protéines dans des cellules de mammifère en utilisant des nanoparticules polymériques de palladium devrait constituer une avancée majeure dans le domaine de la nanomédecine. Ce projet de recherche est ambitieux et risqué, mais, en cas de succès, devrait ouvrir un nouveau concept thérapeutique. References (1) Prescher, J. A.; Bertozzi, C. R. Nature Chemical Biology 2005, 1, 13. (2) Johnson, J. A.; Lu, Y. Y.; Van Deventer, J. A.; Tirrell, D. A. Curr. Opin. Chem. Biol. 2010, 14, 774. (3) Kirshenbaum, K.; Carrico, I. S.; Tirrell, D. A. Chembiochem 2002, 3, 235. (4) Liu, C. C.; Schultz, P. G. Annu. Rev. Biochem. 2010, 79, 413. (5) Li, J.; Chen, P. R. Chembiochem 2012, 13, 1728. (6) Chalker, J. M.; Wood, C. S. C.; Davis, B. G. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 16346. (7) Spicer, C. D.; Davis, B. G. Chem. Commun. 2011, 47, 1698. 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  • Titre traduit

    Selective intracellular protein modification by Suzuki-Miyaura reaction


  • Résumé

    The proposed project aims to develop palladium-PEG nanoparticles with catalytic ability in order to promote, through Suzuki-Miyaura cross-coupling reaction, the in situ chemical manipulation of intracellular proteins for therapeutic purposes. In living systems, a natural source of aryl iodide, one of the reacting groups in the Suzuki-Miyaura reaction, can be found on an iodinated protein, thyroglobulin. Using the catalytic particles developed, the covalent functionalization of thyroglobulin via intracellular Suzuki-Miyaura coupling will be implemented and optimized. These new bio-orthogonal reaction conditions will then be used to covalently tag the protein as a target for polyubiquitination and subsequent selective destruction by the 26S proteasome. This project represents an original approach in the nanomedicine field.