Conception d'un nanomédicament photostimulable pour la délivrance ciblée et contrôlée de toxines à activité anticancéreuse

par Julien Massiot

Projet de thèse en Pharmacotechnie et biopharmacie

Sous la direction de Véronique Rosilio et de Ali Makky.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Institut Galien Paris-Sud (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    I. Etat de l'art Les immunotoxines sont des protéines résultant de l'assemblage d'une toxine et d'un anticorps qui reconnait spécifiquement les cellules cibles [1]. L'utilisation des immunotoxines pour le traitement du cancer est considérée aujourd'hui comme une voie prometteuse pour contourner les phénomènes de résistance à la chimiothérapie classique. Le traitement consiste à cibler les cellules cancéreuses d'une manière sélective, en utilisant des toxines protéiques capables de tuer les cellules avec une seule molécule [2]. Cependant le caractère lipophile des membranes cellulaires empêche la délivrance intracellulaire directe de ces macromolécules [3]. Plusieurs stratégies ont été élaborées pour faciliter leur pénétration dans le cytoplasme, notamment en les liant à des peptides pénétrants (CPP) ou des anticorps. Cependant, aucune de ces stratégies n'a montré d'amélioration de l'efficacité du traitement [3]. Le traitement des tumeurs par des toxines macromoléculaires vectorisées vers des cibles cytoplasmiques nécessite une endocytose sélective suivie d'une libération de la toxine intacte du compartiment endosome/lysosome vers le cytoplasme. Cette dernière étape représente un défi important en formulation galénique. Au cours des dernières années, plusieurs nanovecteurs pour le traitement de cancer comme les liposomes, les micelles et les nanoparticules polymériques ont été développés pour améliorer l'efficacité, la biodistribution et le ciblage de molécules actives [4]. Cependant l'efficacité de ces nanovecteurs est limitée par l'opsonisation et la clairance rapide des vecteurs, ainsi que par la dégradation des substances actives dans le compartiment endosome/lysosome. Ces facteurs limitent le transfert actif et contrôlé des molécules thérapeutiques vers leur cible [4-6]. La plupart des nanovecteurs ciblés ne permettent pas le contrôle de la libération des molécules actives dans la cellule. Pour remédier à ce problème, des stratégies ont été élaborées comme l'utilisation de stimuli externes (nanovecteurs stimuli-sensibles) pour déclencher la libération locale de la substance active [7-10]. Les nanovecteurs stimuli-sensibles sont capables de libérer leur charge d'une manière contrôlée sous l'effet d'un stimulus appliqué au niveau de la tumeur [4]. Différents stimuli exogènes ou endogènes peuvent être envisagés comme une hyperthermie locale, un champ magnétique, des ultrasons, un changement de pH ou encore un gradient redox [4]. Cependant, il s'est avéré difficile jusqu'à présent de développer un nanovecteur qui, dans les conditions physiologiques, ne libèrerait le médicament encapsulé qu'en présence de ce stimulus externe. En effet, la majorité des nanovecteurs à libération contrôlée décrits jusqu'à présent sont basés sur une hyperthermie de quelques degrés au-dessus de celle du corps humain. Mais ces nanovecteurs peuvent aussi libérer une partie de leur charge d'une façon non contrôlée à 37°C [11]. En outre, l'hyperthermie au niveau de la tumeur pourrait elle-même léser les tissus en induisant une apoptose cellulaire [11,12], indépendamment de la libération contrôlée de la substance active. Par conséquent, il est extrêmement important de développer de nouvelles approches pour la libération contrôlée des molécules thérapeutiques qui permette de surmonter les limitations décrites précédemment. II. Objectifs L'objectif principal de la thèse est de concevoir un nouveau système de délivrance ciblée et stimulus-sensible, permettant la libération contrôlée d'une toxine à activité anticancéreuse pour le traitement du cancer de l'œsophage. Ce système se fonde sur des liposomes « intelligents » pégylés portant à leur surface un anticorps de reconnaissance du récepteur de facteur de croissance anti-épidermique surexprimé à la surface des cellules du carcinome de l'œsophage [13], et encapsulant une protéine d'activité anticancéreuse (toxine), qui ne sera libérée dans la cellule cancéreuse qu'après illumination de la tumeur par un laser de longueur d'onde appropriée. Pour cela, la matrice lipidique des liposomes sera dopée avec des porphyrines de rendement quantique élevé d'oxygène singulet [14]. L'illumination des vésicules induira une oxydation de la matrice des chaînes alkyl insaturées, aboutissant à une augmentation de la perméabilité des liposomes et à la libération de leur cargo. Une telle augmentation de la perméabilité membranaire a déjà été démontrée sur des vésicules géantes en utilisant des dérivés de porphyrines liés par une liaison covalente à la chaine alkyl des phospholipides [15,16]. En outre, nos travaux récents ont montré une augmentation significative de bicouches lipidiques contenant des phospholipides oxydés [17]. III. Plan de travail Le plan de travail de la thèse s'articulera en 3 étapes : A) La formulation de liposomes encapsulant une sonde fluorescente et dopés de différentes porphyrines afin de déterminer le ratio optimal lipides/porphyrines permettant d'obtenir le meilleur profil de libération. L'effet de l'illumination sur la cinétique et la quantité de sonde fluorescente libérée sera étudié par spectroscopie de fluorescence. Une fois le ratio optimal lipides/prophyrines déterminé, une toxine sera encapsulée dans les liposomes en utilisant des méthodes assurant une encapsulation maximale et stable de la protéine. La cinétique de libération de la protéine sera étudiée après illumination de ces liposomes. B) L'étude approfondie (1) de l'effet de l'illumination sur la matrice lipidique des liposomes et (2) du mécanisme de libération du cargo sera réalisée par l'analyse de la structure et des propriétés mécaniques des membranes lipidiques avant et après illumination, sur 3 types de modèles membranaires : (i) des monocouches lipidiques à l'interface air/eau, en utilisant des techniques physiques couplées à la balance de Langmuir. La modification de la structure fine perpendiculaire à la surface membranaire (épaisseur, rugosité, et densité de longueur de diffusion) des mélanges lipides/porphyrines sera révélée par réflectométrie spéculaire des rayons X (XRR). La diffraction des rayons X à incidence rasante (GIXD) permettra le calcul de l'ordre latéral des chaines alkyl des phospholipides (ex : la distance entre les chaines alkyl, l'aire occupée par chaque chaine, l'inclinaison et l'orientation des chaines). (ii) des liposomes unilamellaires en utilisant la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), la mesure d'anisotropie de fluorescence, et calorimétrie à balayage différentiel (DSC) qui permettent de mesurer les changements au niveau de la transition de phase des chaines alkyl en fonction du degré d'oxydation et de la fraction molaire des composés oxydés après illumination. (iii) des vésicules unilamellaires géantes (GUV) sur lesquelles l'influence de l'illumination sur le mécanisme de perméabilisation membranaire et les propriétés mécaniques sera étudié par microscopies confocale et à contraste de phase. C) La formulation et l'évaluation de l'efficacité cytotoxique des nanovecteurs à libération contrôlée par la lumière: les liposomes furtifs (pégylés) portant le ligand de reconnaissance, les porphyrines et contenant la toxine seront fabriqués pour l'évaluation de leur efficacité sur culture cellulaire. L'anticorps de ciblage thiolé sera fixé d'une manière covalente sur l'extrémité maléimide de la phosphatidyléthanolamine-PEG-maléimide. La quantification et la cinétique de libération de la toxine seront déterminées dans le surnageant par spectroscopie de fluorescence en utilisant un kit de dosage protéique. La stabilité des préparations liposomiales en fonction du temps sera suivie par diffusion quasi-élastique de la lumière (DLS). La cytotoxicité et l'efficacité des nanovecteurs en présence et en l'absence des anticorps spécifiques seront comparées sur différentes lignées cellulaires dont la lignée TE5 de carcinome de l'œsophage. Enfin, l'efficacité et la sélectivité de ce système de délivrance contrôlée sera analysé sur des cellules TE5 adsorbées sur un cristal de quartz couvert de SiO2 en utilisant la microbalance à cristal de quartz (QCM-D) qui permet de quantifier des interactions spécifiques et de déterminer la masse des matériaux adsorbés et leur propriétés viscoélastiques [18]. IV. Collaborations Le projet de thèse est un sujet interdisciplinaire combinant l'expertise de notre unité de recherche (UMR CNRS 8612) dans le domaine de délivrance médicamenteuse et celui de la physicochimie expérimentale de notre équipe, l'extraction des produits naturels (Pr. Michael Wink, université de Heidelberg, Allemagne), la physique expérimentale (Pr. Motomu Tanaka, université de Heidelberg), la synthèse des dérivés de porphyrines (Dr. Philippe Maillard, Institut Curie, Orsay) et la production des anticorps (Dr. Cécile Feraudet-Tarisse, iBiTec-S, CEA Saclay). Toutes ces collaborations existent déjà.

  • Titre traduit

    Design and formulation of a new photoactivable controlled-released targeted drug delivery system for cancer therapy


  • Résumé

    I. State of Art Immunotoxins are proteins containing a toxin along with an antibody or growth factor that binds specifically to target cells [1]. The use of immunotoxins is considered nowadays as a promising field for emerging anti-cancer agents to overcome resistance to chemotherapy. Indeed, the treatment of tumors with immunotoxins consists in targeting the surface of cancer cells with considerable potency, using protein toxins capable of killing a cell with a single molecule [2]. However, the lipophilic nature of the biological membranes restricts the direct intracellular delivery of such macromolecules [3]. Several strategies have been used in order to facilitate toxins penetration into cells, by linking these molecules to antibodies or cell penetrating peptides (CPP). However, none of these strategies has shown an enhancement of the drug efficiency [3]. The treatment of tumors with macromolecular toxins addressed to cytoplasmic targets requires selective endocytosis followed by release of the intact toxin from the endosomal/lysosomal compartment into the cytoplasm. The latter step remains a particular challenge. Over the past few years, several clinically approved nanocarriers such as liposomes, micelles and polymeric nanoparticles have been developed to improve the biodistribution drug targeting as well as drug efficacy of various bioactive molecules [4]. However, these nanocarriers may encounter many physiological barriers after their intravenous administration including opsonisation, rapid clearance and degradation of the encapsulated active molecules in the endosomal/lysosomal compartment. Such barriers limit the transfer of active molecules to their specific targets in a controlled manner [4-6]. Indeed, most of the targeted nanocarriers do not allow the control of drug release kinetics within the cell. Thus, to address this problem, other strategies have been pursued such as the use of external stimuli to trigger the local drug release [7-10]. Stimuli-responsive nanomedicines are able to release their drug payload in a spatial, temporal, and dose-controlled fashion [4]. Stimuli allowing control of drug release can be exogenous such as temperature, magnetic field, ultrasound waves, light or electric pulses, or endogenous such as pH, intracellular enzymes or redox gradients [4]. Overall, it has proved challenging to develop a nanocarrier that in physiological conditions retains the drug in the absence of an external stimulus, but would release it when activated by the stimulus. As nearly all biocompatible triggered release mechanisms described so far are based on a thermal transition a few degrees above body temperature, these carriers naturally exhibit a substantial amount of uncontrolled release at 37°C [11]. Furthermore, using temperature-triggered nanocarriers with phase transitions at high temperatures is not practical, as the heating required for the release could destroy the target tissue and induce apoptosis [11,12], independently of the drug release provoked by the external stimulus. Therefore, it is extremely important to develop new methods for controlling drug or therapeutic peptide release, which overcome some of the limitations of the previously described systems. II. Objectives The main objective of the proposed research is to establish a new selective nanocarrier system for the treatment of oesophageal carcinoma. This nanocarrier will be based on lipid vesicles encapsulating an anti-cancerous protein (toxin), which can be released in the cancerous cell upon illumination of the tumour in a controlled manner. This system will be based on pegylated liposomes bearing at their surface an active targeting ligand (murine monoclonal antibody (B4G7) of the anti-epidermal growth factor (EGF) receptor, which is overexpressed on esophageal squamous cell carcinoma [13]). These liposomes will be doped with dimeric porphyrins with high singlet oxygen production, allowing release of the encapsulated peptide upon illumination in the near infrared region (NIR 700-1300nm) with a laser. Such molecules have been proposed as photosensitizers in photodynamic therapy (PDT) for cancer treatment in which their illumination induces the generation of singlet oxygen and reactive oxygen species (ROS) [14]. Similar to PDT, it is expected that the illumination of liposomes doped with porphyrins will induce chemical oxidation of the unsaturated alkyl chains matrix, resulting in an increased membrane permeability and possibly pore formation [15]. Such enhancement of membrane permeability has already been demonstrated on giant vesicles (GUV), using porphyrin derivatives covalently linked to phospholipids alkyl chains [15,16]. In addition, our recent work has shown an increase in the permeability of lipid bilayers containing oxidized phospholipids [17]. III. Research plan The proposed project is divided in 3 parts. A) Formation of liposomes (SUV) with optimal lipid/porphyrin composition: Liposomes doped with various amounts of monomeric and dimeric porphyrin derivatives, and encapsulating a fluorescent probe in their core will be prepared. The effect of illumination on the kinetics and extent of the fluorescent probe release will be assessed by fluorescence spectroscopy. When the optimal lipid/porphyrin composition is found, a protein toxin will be encapsulated into the liposomes using different process of liposomes preparation in order to optimize protein loading efficiency. Then, the release kinetics of the protein upon liposomes illumination will be investigated. B) Determination of the impact of illumination on the lipid matrix of liposomes as well as the mechanism of cargo release: To do so, the structure and mechanics of membranes before and following laser illumination will be investigated on three different membrane model systems: (i) lipid monolayers at the air/water interface, using physical techniques coupled to Langmuir film balances. The modification of the fine structure perpendicular to the membrane surface (thickness, roughness, and scattering length density) of the lipid-porphyrins mixtures will be probed by specular X-ray reflectivity (XRR). Grazing incidence x-ray diffraction (GIXD) enables calculation of the lateral ordering of hydrocarbon chains (e.g. characteristic inter-chain distance, area per chain, chain tilt, direction of the chain tilt, etc.). (ii) Small unilamellar vesicles (SUV) using fluorescence correlation spectroscopy (FCS), fluorescence anisotropy measurements, and differential scanning calorimetry (DSC) where the changes in phase transition properties can be measured as a function of the oxidization degree and molar fraction of oxidized compounds. (iii) Giant unilamellar vesicles (GUV) where the influence of light illumination on the membrane permeabilization mechanism and mechanics of GUV will be assessed with confocal microscopy and Flicker spectroscopy. Some of these techniques will be available through collaborations. C) Formulation and evaluation of pegylated liposomes incorporating porphyrin dimers and encapsulating the toxin. Stealth liposomes will be formulated with phosphatidylethanolamine-polyethylene oxide spacer functionalized at the end with a maleimide group (PE-PEG-maleimide) for fixation of the thiolated antibody. Then the toxin release upon illumination will be quantified in the supernatant by spectrophotometry using a Protein Assay Kit. The stability of the formulation with time will be studied by DLS (dynamic light scattering). In addition, the cytotoxicity and the efficiency of the formulation encapsulating or not the toxin in the presence and absence of the specific antibodies will be assessed in vitro on various cell lines including the esophageal carcinoma TE5 cell line. Finally, the specificity of the drug delivery system will be investigated on a monolayer of TE5 cells adsorbed onto a SiO2-coated quartz crystal using a quartz crystal microbalance with dissipation measurement (QCM-D) where the adsorbed materials and their viscoelastic properties can be studied [18]. IV. Collaborations The proposed project is an interdisciplinary research combining the expertise in drug delivery systems and experimental physical chemistry, natural product extraction (Pr. Michael Wink, university of Heidelberg), experimental physics (Pr. Motomu Tanaka, university of Heidelberg), porphyrins derivatives synthesis (Institut Curie, Orsay) and antibodies production (iBiTec-S, CEA Saclay).