Rôle des miRNA dans la réponse inflammatoire associée aux flagelles au cours de l'infection par Clostridium difficile

par Hussein Kobeissy

Projet de thèse en Microbiologie

Sous la direction de Imad Kansau.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Bactéries pathogènes et Santé (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    Clostridium difficile est une bactérie entéropathogène responsable de 15 à 25 % des diarrhées consécutives à une antibiothérapie et de 95 % des colites pseudomembraneuses (1). Le nombre de cas d'infections à C. difficile (ICD) a considérablement augmenté ces dernières années, et C. difficile est devenue la bactérie responsable d'infections digestives nosocomiales la plus répandue dans les pays dits développés (2). Cette forte augmentation d'incidence en Amérique du nord et en Europe accompagnée de cas graves et de l'apparition d'épidémies est due à l'apparition de souches dites « hypervirulentes » de C. difficile, comme notamment la souche de PCR ribotype 027. Les principaux facteurs de risque des ICD sont les traitements par les antibiotiques à large spectre (responsables de la destruction de la barrière formée par le microbiote intestinal) et l'âge. Ainsi, les modifications démographiques dues au vieillissement de la population, et l'utilisation massive des antibiotiques contribuent à l'augmentation des ICD. Ces infections sont traitées par une antibiothérapie à base soit de métronidazole, soit de vancomycine, mais les rechutes sont fréquentes avec ces deux traitements et des résistances apparaissent pour le métronidazole. Avant que le processus de lésion de la muqueuse intestinale ait lieu, C. difficile doit franchir la barrière épaisse de mucus puis s'implanter dans l'intestin et coloniser les cellules épithéliales. Si les toxines cytolytiques TcdA et TcdB contribuent directement à la pathologie associée aux infections à C. difficile (1), d'autres facteurs peuvent intervenir dans la colonisation par la bactérie, lui permettant ainsi de produire ses toxines à proximité des cellules cibles. Ainsi, différents facteurs de virulence ont été décrits comme pouvant jouer un rôle dans l'adhésion et la colonisation. Parmi ces facteurs figurent : a) la capsule, facteur anti-phagocytaire (3), b) des adhésines permettant l'adhésion à la muqueuse (4, 5), c) des enzymes hydrolytiques potentiellement impliquées dans la dégradation du mucus (6, 7), d) les deux protéines majoritaires de la surface bactérienne qui composent la couche S (8), et e) les flagelles conférant la mobilité et le chimiotactisme à la bactérie (9). Notre équipe s'intéresse à la caractérisation des structures bactériennes impliquées dans ces phénomènes d'adhésion et de colonisation, et tout particulièrement aux flagelles, exprimés par la grande majorité des isolats cliniques de C. difficile. Les flagelles ont été impliqués dans l'adhérence et la colonisation épithéliale par les bactéries pathogènes Campylobacter jejuni (10), Helicobacter pylori (11), Aeromonas caviae (12) et Pseudomonas aeruginosa (13, 14). Par ailleurs, les flagelles jouent également un rôle dans l'internalisation de C. jejuni (15, 16) et Legionella pneumophila (16), ainsi que dans le déclenchement de la réponse inflammatoire de l'épithélium pulmonaire au cours de l'infection par P. aeruginosa (17, 18) et de l'épithélium intestinal dans le cas de Salmonella (19, 20). En effet, les flagellines, composants structuraux des flagelles de ces bactéries, atteignent le récepteur TLR5 (Toll like receptor-5) exposé au pôle apical des cellules épithéliales respiratoires ou au pôle baso-latéral des cellules épithéliales intestinales, stimulant ainsi la voie de signalisation liée à ce récepteur, à savoir l'activation des MAPKs et de NF-kB, responsables de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (notamment IL-8) et de l'initiation d'une réponse immunitaire adaptative en réponse à ces pathogènes (19, 21, 22). Notre équipe a caractérisé sur le plan moléculaire les gènes fliC et fliD, codant respectivement la sous-unité structurale majeure (flagelline) et la protéine de coiffe des flagelles péritriches de C. difficile (9, 23). Par ailleurs, des expériences menées in vitro avec les protéines FliC et FliD purifiées, et in vivo sur le modèle animal de souris axéniques avec des souches non flagellées « naturelles », suggéraient le rôle des flagelles de C. difficile dans le processus de colonisation. Récemment, nous avons poursuivi l'étude in vitro et in vivo du rôle des flagelles de C. difficile dans la réponse inflammatoire via l'interaction avec le TLR5, et nous avons mis en évidence l'activation par les flagelles de C. difficile des voies de signalisation des MAPKs ERK1/2, JNK et p38 et de NF-kB sur deux modèles de cellules épithéliales exprimant le TRL5 humain. L'utilisation d'inhibiteurs spécifiques des différentes voies de signalisation et de siRNA, couplée à l'analyse de l'activation de leurs effecteurs, de l'expression des gènes codant ces effecteurs ainsi que de la production de cytokines proinflammatoires, nous a permis de démontrer que la voie de NF-kB est la voie principalement activée par les flagelles de C. difficile. Nous avons également pu détailler ces voies de signalisation grâce à une étude transcriptomique ciblée sur les effecteurs impliqués dans ces voies mais aussi sur les différentes cytokines proinflammatoires dont la production est issue. Par la suite, nous avons étudié le rôle des flagelles de C. difficile dans le développement de la réponse pro-inflammatoire in vivo, dans un modèle murin. Nous avons comparé la réponse inflammatoire intestinale induite lors de l'infection par différentes souches de C. difficile (R20291, hypervirulente et 630Δerm, non épidémique), et leurs mutants isogéniques non flagellés et non toxinogènes mais flagellés. L'analyse histologique des caecums, ainsi que l'étude de l'activation des effecteurs des voies de signalisation des MAPKs et de NF-kB, et de l'expression des gènes codant ces effecteurs, a confirmé les résultats de nos études in vitro sur l'implication des flagelles de C. difficile dans le développement d'une réponse inflammatoire in vivo. En effet, les toxines à elles seules ne semblent pas induire le degré d'inflammation observé dans notre modèle d'infection. En revanche, l'ensemble de nos résultats suggère bien le rôle prépondérant des toxines pour faciliter l'interaction entre les flagelles et le TLR5 (article soumis pour publication). Différents mécanismes de régulation des voies de signalisation des TLR ont été décrits. Parmi ces mécanismes, des courtes séquences d'ARN non codant appelés microARN (miRNAs) jouent un rôle d'immunomodulateurs de la réponse innée par la régulation des voies dépendantes des TLR. Les miRNAs sont des courtes séquences d'ARN naturels de 21 à 24 nucléotides, non traduits, responsables de la régulation post-transcriptionnelle des gènes par leur action spécifique sur les ARNm (24). L'expression des miRNAs est induite par l'activation des TLRs et leurs rôles dans l'activation ou l'inhibition d'effecteurs des cascades de signalisation semblent essentielles à la modulation de la réponse inflammatoire. Ils agiraient sur l'expression des cibles effectrices et des facteurs de transcription des voies de l'inflammation, mais aussi des récepteurs TLR eux-mêmes (25, 26). Le rôle des miRNAs dans la régulation génique et leur mécanisme d'action permet d'envisager le fait que ces petits ARN puissent constituer une nouvelle cible mais aussi une stratégie thérapeutique potentielle. Par ailleurs, récemment, des profils de miRNAs circulant ont été décrits dans des pathologies comme le cancer et les maladies inflammatoires, et des tests diagnostiques ont déjà fait l'objet de commercialisation pour le cancer du poumon et du rein. A ce jour il n'y a pas de rapport de la littérature sur des miRNAs spécifiques à l'infection par C. difficile. L'analyse transcriptomique ciblée sur les effecteurs des voies de signalisation activées lors de l'interaction TLR5-flagelle de C. difficile a révélé une diminution de l'expression du gène codant le récepteur TLR5 lui-même chez les animaux infectés par les souches flagellées, suggérant une régulation négative du TLR5. Nous nous proposons d'étudier la régulation de l'expression du TLR5, ainsi que des effecteurs de la cascade de signalisation de NF-kB, notamment par les miRNAs. Les conséquences d'une telle régulation pourraient avoir une incidence dans le degré de la réponse inflammatoire et donc dans des manifestations cliniques observées durant l'infection intestinale par C. difficile. Cet aspect de la régulation de la réponse inflammatoire pourrait apporter des éléments nouveaux à considérer dans le contrôle des formes graves d'infection par la bactérie.

  • Titre traduit

    Role of miRNA in the flagella-induced inflammatory response during Clostridium difficile infection


  • Résumé

    Clostridium difficile is a Gram-positive anaerobic bacterium that colonizes the intestine of humans and animals. Antibiotic exposure, hospitalization, and advanced aged are the major risks factors associated with C. difficile infection (CDI) (1). CDI can range from mild diarrhea to severe life-threatening pseudomembranous colitis. Since 2003, the prevalence of severe disease and relapse rates, as well mortality of CDI have increased dramatically in North America and Europe (2, 3). These observations have mainly resulted from the emergence of highly virulent C. difficile strains such as BI/NAP1/027 strains, which have rapidly spread from North America throughout European countries (3, 4). Although the toxins TcdA and TcdB contribute directly to CDI-associated lesions of the gut (5, 6), other factors appear to be involved in the intestinal colonization, allowing C. difficile to produce toxins in the vicinity of target cells. These factors include adhesins for adherence to the mucosa (7-10), hydrolytic enzymes potentially involved in mucus degradation (11, 12), the two S-layer proteins (13), and flagella, which confer motility and chemotaxis (14). Involvement of flagella in the adherence and colonization of mucosa have been demonstrated in pathogens Helicobacter pylori (15), Aeromonas caviae (16), Pseudomonas aeruginosa (17), and Campylobacter jejuni (18). Moreover, internalization of C. jejuni and Legionella pneumophila into epithelial cells is mediated by flagella (19, 20). Bacterial flagella also play important roles in regulating the expression of non-flagellar genes through their functions as sensors of the environment (21). Concerning C. difficile, we recently showed that disruption of the fliC gene encoding flagellin leads to pleiotropic effects on gene regulation during in vivo infection, which is directly or indirectly involved in high mortality rates observed in animals infected by this mutant (22). Otherwise, bacterial flagella are involved in the development of an inflammatory host response in mucosal epithelia. Inflammatory lesions triggered by flagella occur in the pulmonary epithelium in P. aeruginosa infections (23), and in the intestinal epithelium in Salmonella infections (24). Indeed, bacterial flagellins are specifically recognized by Toll-like receptor 5 (TLR5) which are expressed at the apical membrane of respiratory epithelial cells and the basolateral pole of intestinal epithelial cells. This interaction elicits signaling pathways involving mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and nuclear factor-kappa B (NF-kB), which are responsible for the secretion of pro-inflammatory cytokines and for initiating an immune response against these pathogens (25). We have focused our study on C. difficile flagella (motility structure), which are involved in the pathogenesis of bacteria. To date, few studies have addressed the role of C. difficile flagellin via TLR5 in the induction or amplification of an immune response deleterious to the host. In a recent work, we analyzed the TLR5 signaling elicited by C. difficile flagella in vitro and in vivo in a mouse model. We showed in two different epithelial cell models that C. difficile flagellin predominantly activates the NF-kB and, in a lesser degree, the MAPK pathways, via TLR5, which elicit the synthesis of pro-inflammatory cytokines. We also showed that C. difficile flagellin up-regulates pro-inflammatory gene expression which elicits the synthesis of pro-inflammatory cytokines, and down-regulates the TLR5 expression in epithelial cell models. In vivo, we observed that the absence of flagella in toxin-producing bacteria dramatically decreased the mucosal inflammation degree in mice (submitted). Interestingly, the only presence of toxins without flagellin was not enough to elicit epithelial lesions observed in infected mice. These results strongly suggest an essential role for C. difficile flagella in eliciting inflammation and mucosal lesions as long as toxins exert their action on the epithelium. Different regulatory mechanisms of TLR signaling pathways have been described. Among these, short sequences of non-coding RNA called microRNA (miRNAs) play an immunomodulatory role of the innate response by regulating TLR-dependent pathways. miRNAs are short natural RNA sequences of 21 to 24 nucleotides, untranslated, responsible for post-transcriptional regulation of genes by their specific action on the mRNA (26). The expression of miRNAs is induced by activation of the TLRs and their role in the activation or inhibition of signaling cascade effectors seems critical to the modulation of the inflammatory response. They target the inflammation pathway effectors and transcription factors, as well as TLRs themselves (22, 27). The role of miRNAs in gene regulation and their mechanism of action allow to consider the fact that these small RNAs may be a new target but also became a potential therapeutic strategy. Moreover, circulating miRNA profiles were described in cancer and inflammatory diseases, and diagnostic tests have already been marketed for lung and kidney cancer. To date no report in the literature addresses the specific role of miRNA in C. difficile infection, particularly in the inflammatory response elicited by C. difficile flagellin via TLR5. Our transcriptomic analysis of signaling pathways following C. difficile flagella-TLR5 interaction showed a decreased expression of the TLR5 gene itself in mice infected with flagellated strains. This suggests a TLR5 down regulation during infection. We propose to study the role of miRNA in the regulation of the TLR5 and NF-kB signaling pathway effectors following the C. difficile flagella-TLR5 interaction. The consequences of this regulation could impact the degree of host inflammatory response and therefore the clinical outcome observed during C. difficile intestinal infection. This aspect of the regulation of the inflammatory response will provide new insights to be considered in the control of severe forms of C. difficile infection. Objectives : 1.To study the in vitro miRNAs expression following the TLR5-associated signaling elicited by the C. difficile flagellin in Caco-2 epithelial cells. 2.To study the in vivo expression of the miRNAs in the caecum and the serum in a mouse model of C. difficile infection.