Rôle des neutrophiles dans l'hypersensibilité de contact. Implication de la voie Nrf2.

par Doumet Helou

Projet de thèse en Toxicologie

Sous la direction de Sylvie Chollet-martin et de Saadia Kerdine-römer.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Cytokines, chimiokines et immunopathology (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    1. Etat de la question L'hypersensibilité de contact (HSC) est une réaction inflammatoire de la peau en réponse à une exposition répétée ou prolongée à des molécules allergisantes de faible poids moléculaire, appelées des haptènes. Au cours de l'HSC, on distingue une phase de sensibilisation pendant laquelle une réponse immunitaire spécifique est mise en place, et une phase de révélation clinique lors de la réintroduction de la molécule et l'activation des lymphocytes T (LyT) effecteurs spécifiques. Notre équipe possède une expertise in vitro sur ces modèles et a, de plus, récemment développé un modèle de souris invalidée pour le gène codant pour le facteur de transcription NRF2 (NRF2-/-), largement impliqué dans la réponse aux stress. Nous avons ainsi montré qu'au cours de l'HSC à des haptènes, ces souris NRF2-/- développaient des réponses inflammatoires plus fortes, avec un seuil de réponse diminué ; nous avons également documenté les mécanismes in vitro dans différents modèles (1, 2, 3). Les polynucléaires neutrophiles (PN) jouent un rôle majeur dans l'inflammation grâce à de nombreuses propriétés fonctionnelles, comme la migration, l'explosion oxydative, la libération de protéases et cytokines ou la formation de « Neutrophil Extracellular Traps » ou NETs sur lesquels notre équipe développe sa recherche. Ces NETs sont constitués de chromatine parsemée de protéines provenant des différents compartiments cellulaires (4). Notre équipe a mis au point un modèle standardisé de production, purification et identification des NETs à partir de neutrophiles humains (4). Nous avons ainsi montré que ces NETs diminuaient, in vitro, la capacité de maturation complète de cellules dendritiques dérivées de monocytes humains (moDCs) ; ces moDC maturées en présence de NETs ont également une capacité réduite à activer la prolifération des LyT in vitro et favorisent une polarisation Th2 (5). En parallèle de ces études in vitro, nous développons des travaux in vivo chez l'homme pour documenter l'implication des NETs dans les réactions d'hypersensibilité immédiate au cours du choc anaphylactique per-anesthésique aux curares myorelaxants. Enfin, nous avons récemment démontré qu'en réponse au nickel in vitro, les neutrophiles libéraient des microparticules ou ectosomes capables de réguler la réponse des moDCs et d'orienter la réponse lymphocytaire T (6). Récemment, nos collaborateurs en Allemagne ont identifié les PN comme cellules indispensables à l'HSC, dans un modèle murin (Weber FC et al., J Exp Med, 2015). Toutefois, les mécanismes sont encore peu connus. 2. Objectifs du sujet L'objectif principal de ce projet est de mieux comprendre le rôle des PN dans la physiopathologie de l'HSC, chez des souris sauvages et des souris nrf2-/-. Les objectifs spécifiques seront les suivants : - Comparer la cinétique et l‘intensité d'accumulation des PN et des NETs, dans la peau de souris sauvages et nrf2-/- au cours d'un modèle d'HSC développés au laboratoire et de sévérité différente. Pour cela, nous travaillerons avec un sensibilisant fort tel que le 2,4 dinitrochlorobenzène (DNCB) connu pour induire une réponse inflammatoire dans les deux génotypes ( nrf2+/+ & nrf2-/-) et un sensibilisant intermédiaire le cinnamaldehyde A (CinA), n'induisant n'induisant aucune réponse inflammtoire dans le modèle de souris sauvage (nrf2+/+). - Evaluer, in vitro et in vivo, l'effet des neutrophiles, et éventuellement des NETs purifiés, sur la réponse LyT CD8+ spécifiques au DNCB et au CinA. - Caractériser, in vitro, les capacités fonctionnelles des neutrophiles issus de souris nrf2-/-. - Identifier les médiateurs moléculaires des PN indispensables à l'HSC . 3. Méthodologie employée - Immunophénotypage des cellules sanguines et des cellules (mastocytes, cellules dendritiques, macrophages) infiltrant la peau et les organes lymphoïdes des souris, par cytométrie en flux et par immunohistochimie. - Isolement et caractérisation des PN de la moelle osseuse : . Quantification de l'explosion oxydative des neutrophiles par chimioluminescence . Analyse de la production de cytokines et autres médiateurs inflammatoires par quantification des ARNm (PCR quantitative) et dosage des cytokines par système multiplex. . Analyse de la capacité des PN à former des NETs (cinétique de production par fluorescence de l'ADN extracellulaire et observation des NETs par microscopie à fluorescence) . Evaluation de la capacité des PN à activer la réponse des LyT CD8+ par des co-cultures in vitro et par transfert adoptif des neutrophiles à des souris naïves. - Utilisation des souris invalidées pour différents médiateurs inflammatoires des PN (élastase, NADPH oxydase) et utilisation de souris Nrf2-Flox et MRP8-Cre pour étudier le rôle de Nrf2 dans un contexte PN restreint - Traitement de souris avec différents agents pharmacologiques visant à dépléter les neutrophiles et à bloquer ou à induire la migration et l'activation des neutrophiles ainsi que la production des NETs (AC anti-Lys6G, DNase).

  • Titre traduit

    Role of neutrophils in contact hypersensitivity. Implication of Nrf2 pathway.


  • Résumé

    1. State of the art Contact hypersensitivity (CHS) is an inflammatory reaction of the skin in response to repeated or prolonged exposure to allergenic molecules of low molecular weight, called haptens. During HSC, two steps can be identified: the sensitization phase during which a specific immune response is established, and the elicitation phase during the reintroduction of the molecule and the activation of T lymphocytes (T Ly) specific effectors. Our team has expertise in these in vitro models and has, moreover, recently developed a mouse model invalidated for the gene encoding the transcription factor Nrf2 (Nrf2 - / -), heavily involved in the response to stress. We have shown that during the CHS to haptens, these Nrf2 - / - mice developed inflammatory strongest responses with a decreased response threshold; we have also documented in vitro mechanisms of Nrf2 in different patterns (1, 2, 3). Polymorphonuclear Neutrophils (PMN) play a major role in inflammation through numerous functional properties, such as migration, oxidative burst, release of cytokines or proteases and the formation of 'Neutrophil Extracellular Traps' or NETs on which our team develops its research. These NETs are composed of chromatin decorated by sevral proteins from various cellular compartments (4). Our team has developed a standardized model of production, purification and identification of NETs from human neutrophils (4). We have shown that these NETs decreased in vitro maturation full capacity of human monocyte-derived dendritic cells (moDCs); these MoDCs matured in the presence of NETs also have a reduced ability to activate TLy proliferation in vitro and favor a Th2 polarization (5). In addition to these in vitro studies, we develop work in vivo in humans to document the involvement of NETs in immediate hypersensitivity reactions in the per-anesthetic anaphylaxis to muscle relaxants. Finally, we have recently demonstrated that in response to nickel in vitro, neutrophils were releasing microparticles or ectosomes able to regulate the response of moDCs and polarize the T cell response (6). Recently, our collaborators in Germany have shown that PMN were essential to CHS, in a mouse model (FC Weber et al., J Exp Med, 2015). However, the mechanisms are still poorly understood. 2. Objectives of the subject The main objective of this project is to better understand the role of PMN in the pathophysiology of CHS in wild-type mice and nrf2 - / - mice. The specific objectives will be: - To compare kinetics and PMN accumulation intensity, as well as NET presence, in both wild-type and nrf2 - / - mouse skin during a CHS model developed in the laboratory with different severities. For this, we will work with a strong sensitizer such as 2,4 dinitrochlorobenzene (DNCB) known to induce an inflammatory response in both genotypes (nrf2 + / + & nrf2 - / -) and an intermediate sensitizer the cinnamaldehyde A (Cina) which does not induce any response in the wild-type mouse model (nrf2 + / +). - To evaluate the in vitro and in vivo effect of neutrophils, and possibly purified NETs, on specific CD8 +TLy response to DNCB and Cina - To characterize, in vitro, the functional capacities of PMN from mice nrf2 - / - mice - To identify the molecular mediators of PMN essential for CHS. 3. Methodology - Immunophenotyping of blood cells and cells (mast cells, dendritic cells, macrophages) infiltrating the skin and the lymphoid organs of mice by flow cytometry and immunohistochemistry. - Isolation and characterization of bone marrow PMN: . Quantification of PMN oxidative burst by chemiluminescence . Analysis of the production of cytokines and other inflammatory mediators by the quantification of mRNA (quantitative PCR) and cytokines using multiplex assay . Analysis of the capacity of PMN to form NETs (kinetic fluorescence production of extracellular DNA and observation of NETs by fluorescence microscopy) . Evaluation of the ability of PMN to activate the CD8 + TLy response by co-cultures in vitro and adoptive transfer o PMN to naive mice - Use of knockout mice for different PMN inflammatory processes (elastase, NADPH oxidase…) and use of Nrf2-Flox and MRP8-Cre mice to study the role of Nrf2 in a restricted PMN context - Treatment of mice with various pharmacological agents to deplete neutrophils and to block or induce their migration and activation as well as the production of NETs (AC anti-Lys6G, DNase…).