Prise de contrôle du métabolisme cellulaire par le bacteriophage T5: une étude vers le développement de nouveaux antibactériens

par Léo Zangelmi

Projet de thèse en Biochimie et biologie structurale

Sous la direction de Pascale Boulanger et de Pascale Boulanger.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (2015-.... ; Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine) , en partenariat avec Université Paris-Sud (établissement opérateur d'inscription) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    Les bactériophages, prédateurs naturels des bactéries, tuent leur hôte avec une grande efficacité. C'est au tout début du cycle viral qu'ils déjouent les mécanismes de défense et réorientent le métabolisme de leur hôte au profit de leur propre réplication. L'étude des stratégies utilisées par les phages pour prendre le contrôle de l'hôte est encore très peu avancée, or elle est essentielle à plus d'un titre: i) Les gènes précoces, très variables d'un phage à l'autre, n'ont pas d'homologues connus. Ils représentent donc un réservoir de fonctions inexplorées cruciales pour la neutralisation des fonctions bactériennes. ii) En décryptant les mécanismes moléculaires de cette mise sous contrôle de l'hôte, nous pourrons identifier les fonctions bactériennes affectées par les phages, qui constituent des cibles potentielles pour de nouveaux agents antibactériens. Pour explorer les étapes précoces de l'infection, nous utilisons le phage T5 qui présente une mode d'infection tout à fait singulier. T5, qui infecte Escherichia coli, est le seul phage connu qui injecte son ADN en deux étapes. Après fixation de T5 à son récepteur FhuA, seulement 8% du génome pénètrent dans la bactérie, puis le transfert est stoppé. Les protéines précoces codées par cette région du génome sont alors exprimées et agissent sur les fonctions vitales de l'hôte: l'ADN bactérien est massivement dégradé, la RNA polymérase est détournée vers la transcription des gènes viraux, les systèmes de restriction/modification et de réparation de l'ADN sont inactivés. Deux des protéines précoces, A1 et A2, sont requises pour la reprise du transfert de l'ADN, qui a lieu après quelques minutes, permettant le déroulement complet du processus infectieux. De plus, la synthèse de A1 commande la dégradation de l'ADN bactérien et le détournement de la machinerie de transcription. Nous disposons de phages mutés dans les gènes A1 et A2, ce qui permet d'étudier la fonction des gènes précoces et leurs interactions avec les protéines de l'hôte alors que le transfert de l'ADN est bloqué à la première étape. Ces propriétés de T5 permettent d'étudier le détournement des fonctions cellulaires indépendamment des autres étapes de l'infection (réplication du génome et assemblage de la particule virale). Ce projet de thèse s'inscrit dans l'étude globale des mécanismes moléculaires qui contrôlent le transfert de l'ADN en deux étapes et la neutralisation des ressources de l'hôte. Le premier objectif est de caractériser la fonction des protéine A1 et A2. Ces protéines peuvent être surproduites et purifiées et nous avons débuté leur caractérisation biochimique. Des mutants de T5 seront construits, codant pour A1 ou A2 fusionnées avec des étiquettes de type 'TAP-tag' afin d'identifier les protéines virales et bactériennes partenaires de A1 et A2 au début de l'infection. Les interactions ainsi établies seront analysées in vitro en reconstituant les complexes à partir des protéines purifiées. Si ces complexes peuvent être obtenus de manière stable, leur caractérisation structurale sera effectuée. Ce projet intégrera également l'identification d'autres gènes précoces impliqués dans la neutralisation des fonctions bactériennes. Différentes données génétiques indiquent que seulement 5 gènes, en plus de A1 et A2, sont essentiels pour l'arrêt immédiat de la croissance de l'hôte et le détournement de son métabolisme. La fonction et les partenaires de ces protéines précoces seront explorés par des approches génétiques et biochimiques.

  • Titre traduit

    Takeover of host metabolism by bacteriophage T5: a study towards the development of new antibacterial drugs


  • Résumé

    Bacteriophages, the natural predators of bacteria, can kill their host with high efficiency. In the early stages of infection phages defeat bacterial defenses and exploit specific cellular functions to serve their needs and propagate in their host. The strategies by which phages take over the host cell resources remain obscure and have been studied in a very limited number of phages. An up to date investigation of these mechanisms is essential for the main following reasons: i) The early-expressed genes are highly diverse from one phage to another and most of them have no assigned function. They thus represent a library of novel genes whose functions are crucial for host neutralization. ii) By deciphering the mechanisms of host takeover, we expect to identify host factors targeted by phage, which constitute attractive targets for new antimicrobial drugs. We use the Escherichia coli phage T5 as a model system to investigate the early stages of phage infection. T5 uses a unique two-step DNA delivery strategy that controls the timing of host function diversion. After binding of T5 to its host receptor FhuA, only 8% of the genome enters the bacterial cell before injection temporarily stops. Early proteins encoded by this region of the genome are then expressed and affect vital host functions: the bacterial DNA is degraded, the RNA polymerase is redirected towards the transcription of viral genes, the systems of restriction/modification and of DNA repair are inactivated. Two of early proteins, A1 and A2, are required for resuming the DNA transfer, which takes place after a few minutes, allowing the completion of the infectious process. Moreover the synthesis of A1 controls the onset of bacterial DNA degradation and transcription machinery hijacking. As we have T5 mutants of the A1 or A2 proteins, we can “freeze” infection just after the first step transfer of the viral genome. This gives us the opportunity to investigate the mechanism of host takeover independently of the further steps of phage replication and assembly. This PhD project is part of a global study of the molecular mechanisms, which control the two-step DNA transfer and the neutralization of host resources. First, it aims at characterizing the function of A1 and A2 proteins. These proteins can be overproduced and purified and we have undertaken their biochemical characterization. New mutants of T5 will be constructed, encoding tag fusion proteins A1 or A2 (type “TAP-tag”) in order to identify the viral and bacterial partners of A1 and A2 at the onset of infection. The interactions established in this way will be analyzed in vitro by reconstituting the complexes starting from purified proteins. If stable complexes can be obtained, their structural characterization will be carried out. This project will also include the identification of other early genes involved in the neutralization of bacterial functions. Genetic data indicate that only 5 genes, besides A1 and A2, are essential for the immediate diversion of the bacterial metabolism. The functions and partners of these early proteins will be investigated by genetic and biochemical approaches.