Étude de l'effet de nouveaux ligands de la cyclophiline D sur l'ouverture du pore de transition de permabilité mitochondrial et étude de leur effet cardioprotecteur

par Mathieu Panel

Projet de thèse en Sciences pharmacologiques

Sous la direction de Didier Morin.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Physiopathologie et pharmacologie des insuffisances coronaires et cardiaques (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2014 .


  • Résumé

    Etat de la question Au sein des maladies cardiovasculaires, la triade – insuffisance coronaire – infarctus du myocarde – insuffisance cardiaque reste un problème majeur de santé publique dans les pays industrialisés. La seule option thérapeutique reconnue à ce jour est la reperméabilisation des artères coronaires occluses qui est à l'origine d'une réduction spectaculaire de la morbi-mortalité des patients atteints d'insuffisance coronaire. Toutefois, et paradoxalement, la reperfusion coronaire constitue par elle-même une cause supplémentaire de lésions myocardiques et il est essentiel de trouver de nouvelles approches thérapeutiques que l'on puisse associer aux méthodes de reperfusion pour réduire encore davantage la morbi-mortalité de l'insuffisance coronaire. Un des mécanismes à l'origine des lésions de reperfusion est l'augmentation de la perméabilité des membranes mitochondriales des cardiomyocytes causée par l'ouverture d'un pore membranaire, le « pore de transition de perméabilité » ou mPTP qui peut conduire à la mort cellulaire par nécrose ou apoptose selon la gravité du stress ischémique initial ou du retard à la reperméabilisation des artères coronaires. Inversement, l'inhibition de l'ouverture du mPTP induit une puissante cardioprotection contre les lésions de reperfusion. Dans ce contexte nous nous intéressons particulièrement à une cyclophiline mitochondriale, la cyclophiline D (CyP-D), qui appartient à la famille des peptidyl-prolyl cis-trans isomérases dont un inhibiteur sélectif est la ciclosporine A. Elle joue un rôle clé dans l'induction de l'ouverture du mPTP en diminuant le seuil de la concentration calcique nécessaire à son ouverture et du même coup un rôle crucial dans l'induction des lésions de reperfusion. Les stratégies pharmacologiques permettant d'inhiber la CyP-D sont donc un objectif pharmacologique majeur pour la cardioprotection et la démonstration clinique de cette preuve de concept a pu être faite grâce à la ciclosporine A dont l'administration intraveineuse au début de la reperfusion par angioplastie chez des patients à la phase aigüe d'un infarctus a permis de réduire significativement la taille de leur infarctus. Il est cependant important de pouvoir identifier d'autres inhibiteurs de la CyP-D que la ciclosporine A, notamment des dérivés n'ayant pas de propriétés immunosuppressives associées et dans ce but nous nous proposons d'étudier les propriétés cardioprotectrices d'une nouvelle famille d'inhibiteurs de cette protéine que sont les dérivés de la phényl-pyrrolidine. Ces molécules ont été développées par l'équipe du Pr Jean Michel Pawlovsky (INSERM U955, équipe 18) avec laquelle nous collaborons au sein du CHU Henri Mondor de Créteil. La structure chimique de ces molécules est très différente de celle de la ciclosporine A et elles ne partagent pas les mêmes sites de liaison sur la CyP-D. Elles ont l'avantage d'en inhiber l'activité isomérase sans présenter de propriétés immunosupressives. Nous venons de démontrer que ces molécules ont la capacité d'inhiber l'ouverture du mPTP dans des mitochondries isolées de foie de souris et qu'il existe une parfaite corrélation entre leur capacité à inhiber l'activité isomérase de la CyP-D et à empêcher l'ouverture du mPTP. Ces résultats sont actuellement soumis à publication. Nous souhaitons maintenant savoir si ces molécules originales initialement conçues à des fins hépatoprotectrices ne pourraient pas aussi être d'excellentes candidates pour développer de nouveaux agents cardioprotecteurs, ce qui est le « cœur » du présent projet. Objectifs de l'étude Les objectifs de ce projet de thèse sont donc d'étudier les propriétés cardioprotectrices de ces nouveaux inhibiteurs de la CyP-D. Cette étude se déroulera en quatre étapes : 1) la première étape consistera à mettre en évidence les propriétés «mPTP inhibitrices» de ces molécules dans des mitochondries isolées de cœurs de rats et de souris puis à analyser la relation entre inhibition de l'activité isomérase et l'inhibition de l'ouverture du mPTP. Puis, pour confirmer que leur effet inhibiteur est bien dû à leur interaction avec la CyP-D, nous étudierons leur effet sur l'ouverture du mPTP dans des mitochondries isolées à partir de cœurs de souris délétées pour le gène de la CyP-D. Nous évaluerons aussi l'effet des molécules sur la phosphorylation oxydative, le potentiel de membrane mitochondrial et la production des EROs, paramètres essentiels à connaître pour le développement d'une molécule à visée mitochondriale. Pour l'ensemble de ces tests, les molécules seront systématiquement comparées à la ciclosporine A. 2) l'étape suivante consistera à confirmer l'effet inhibiteur du mPTP de ces molécules au niveau cellulaire. Nous utiliserons des cardiomyocytes adultes fraîchement isolés à partir de cœurs de rat. Ces cellules nécessitent une préparation quotidienne mais sont excitables à la différence des cellules embryonnaires et constituent donc un modèle parfaitement adapté à l'étude de molécules à visée cardioprotectrice. La mise en évidence de l'ouverture du mPTP et de la mort cellulaire se fera au moyen de sondes fluorescentes détectées par microscopie à fluorescence inversée tout d'abord (a) en normoxie puis (b) dans un modèle d'hypoxie-réoxygénation qui mime les conditions d'ischémie-reperfusion. 3) La troisième étape analysera la capacité de ces dérivés phényl-pyrrolidine à interagir avec la CyP-D dans un modèle in vivo : les molécules seront injectées à doses croissantes à des souris délétées ou non pour le gène de la CyP-D, les mitochondries cardiaques étant rapidement extraites après sacrifice pour évaluer la capacité de ces molécules à inhiber le mPTP. 4) Enfin l'ultime étape de ce travail cherchera à évaluer le pouvoir cardioprotecteur de la molécule la plus active (sélectionnée dans les phases précédentes) dans deux modèles murins d'ischémie-reperfusion (souris et rat) utilisés en routine dans le laboratoire. Ces modèles utilisent des protocoles standardisés d'occlusion/reperfusion coronaire. La réduction de la taille d'infarctus sera le critère principal de l'effet cardioprotecteur potentiel de la molécule sélectionnée et nous analyserons aussi ses capacités à protéger les mitochondries cardiaques des conséquences de l'ischémie/reperfusion (amélioration de la phosphorylation oxydative et résistance à l'ouverture du mPTP) comme critère secondaire. Méthodologie employée Les expériences seront réalisées sur des rats Wistar et des souris C57bl6 (laboratoire Janvier). Les souris délétées pour le gène de la CyP-D seront fournies par le laboratoire Jakson. Les animaux seront utilisés après avis favorable du Cometh (comité d'éthique ANSES/ENVA/UPEC). Les mitochondries seront extraites par centrifugation différentielle après homogénéisation du cœur. La fonctionnalité mitochondriale sera évaluée en mesurant la phosphorylation oxydative au moyen d'une électrode de Clark et la production des EROs par spectrofluorimétrie en mesurant la formation d'H2O2 détectée au moyen de l'Amplex Red. L'ouverture du mPTP dans les mitochondries isolées sera évaluée selon deux protocoles : le premier analysera le gonflement mitochondrial en mesurant l'absorption à 540 nm de la suspension mitochondriale par spectrophotométrie, le second évaluera par fluorimétrie la capacité des mitochondries à résister à une surcharge calcique au moyen d'une sonde fluorescente, le calcium Green 5-N. L'ouverture du mPTP dans les cellules sera évaluée dans des cardiomyocytes adultes de rat Wistar isolés par une technique enzymatique grâce à un système de type Langendorf. L'ouverture du mPTP sera détectée par microscopie à fluorescence inversée. Nous utiliserons une sonde fluorescente, la calcéine, qui en présence de chlorure de cobalt, permet de marquer spécifiquement les mitochondries à l'intérieur d'une cellule. De manière concomitante nous marquerons les cellules avec une autre sonde fluorescente, l'iodure de propidium, qui permet d'évaluer la mort cellulaire induite par l'ouverture du mPTP. L'ouverture du mPTP sera provoquée en conditions normoxiques par l'ajout d'un ionophore calcique, le A23187 ou en soumettant les cardiomyocytes à une séquence de 2 hrs d'hypoxie suivie de 2 hrs de réoxygénation. Les expériences d'ischémie-reperfusion coronaire seront réalisées chez la souris soumise à une occlusion coronaire régionale de 45 min suivie de 24 heures de reperfusion. La détermination de la taille de la zone infarcie sera réalisée par coloration du cœur au chlorydrate de triphényltétrazolium qui colore les zones viables en rouge et les zones infarcies en blanc. Quelles que soient les expériences réalisées les résultats seront exprimés comme la moyenne ± SEM des valeurs individuelles obtenues. La comparaison des différents paramètres sera réalisée à l'aide d'une analyse de variance à un facteur suivie d'un test de Scheffé. Compétences requises pour le candidat Une connaissance solide en biochimie et en biologie cellulaire est indispensable pour mener à bien ce projet. Des notions de pharmacologie et une expérience de la culture cellulaire sont aussi nécessaires. Par, ailleurs ce projet nécessite d'être capable de manipuler des rats et des souris. Principales références de l'équipe sur le sujet - Morin D., Assaly R., Paradis S., Berdeaux A. Curr Med Chem, 2009, 16, 4382-4398 - Schaller S, Paradis S, Ngoh GA, Assaly R, Buisson B, Drouot C et al. JPET, 2010, 333, 696-706 - Laure L, Long R, Lizano P, Zini R, Berdeaux A, Depre C, Morin D. Free Radic. Biol. Med. 2012, 52, 2168-2176. - Paradis S, Leoni V, Caccia C, Berdeaux A, Morin D. Cardiovasc. Res., 2013, 98, 420-427. - Woodman OL, Long R, Pons S, Eychenne N, Berdeaux A, Morin D. Pharmacol Res. 2014, 2014, 81, 26-33.

  • Titre traduit

    Effect of new cyclophiline D ligands on mitochondrial permeability transition pore opening. Toward new cardioprotective agents?


  • Résumé

    Ischemic cardiovascular diseases remain a major concern worldwide. The only therapeutic approach relies on a timely reperfusion of the culprit artery to limit the extension of the necrotic area. Nevertheless, reperfusion is, per se, responsible for an increase in infarct size. These additional damages are called “reperfusion injury". One of the mechanisms involved is an increase in mitochondrial membrane permeability leading to energy depletion and ultimately cell death which is due to the formation and opening of a large conductance channel, the mitochondrial permeability transition pore (mPTP). Opening of the mPTP leads to necrosis or apoptosis according to the intensity or duration of ischemic stress. Inversely, inhibition of mPTP opening allows a powerful reduction of reperfusion injury. In this context, we focus on a mitochondrial cyclophiline, the cyclophiline D (CyPD, which belongs to the peptidyl-prolyl cis-trans isomerases family. CyPD plays a crucial role in mPTP opening, and therefore in reperfusion injury, as it lowers the calcium concentration required for pore opening. Pharmacological strategies aiming to inhibit CyPD represent a major pharmacological objective in term of cardioprotection. The clinical proof of concept of this strategy was provided by the fact that administration of cyclosporine A, a well know CyPD inhibitor, at the time of reperfusion limits infarct size. Nevertheless, the search for new CyPD inhibitors remains a major objective as CsA exhibit numerous limitations such as immunosuppressant activity or toxicities. In this context, we are planning to study the properties of a new family of CyPD inhibitors which are derived from phenyl-pyrrolidine. These compounds were developed by our collaborators (Pr Jean Michel Pawlotsky – Inserm U955 Team 18). The chemical structure of these compounds is totally unrelated to cyclosporine A and they bound at different sites on CyPD. These molecules inhibit CyPD enzymatic activity without exhibiting any immunosuppressive activity. We have previously shown that these compounds inhibit mPTP opening in mitochondria isolated from rat and mouse liver. Now we would like to know if these molecules could be candidates to develop new cardioprotective agents. Aims of the study: This projects aims to identify the cardioprotective properties of the new CyPD inhibitors. 1) In the first step, we will study the effect of these molecules on mPTP opening in cardiac mitochondria isolated from rats and mice. To confirm that their inhibitory effect is due to CyPD inhibition, we are planning to study their effect in mitochondria isolated from mouse hearts devoid of CyPD. We will also study the effect of our coumpounds on mitochondrial oxidative phosphorylation, membrane potential and ROS production. In all experiments, our compounds will be compared to cyclosporine A. 2) Next, we will evaluate the effect of these compounds at the cellular level. We will use adult rat isolated cardiac myocytes. mPTP opening and cell death will be evaluated in fluorescence microscopy experiments in (a) normoxia and (b) in a hypoxia-reoxygenation model which mimics ischemia-reperfusion. 3) The third step of our study will consist in analyzing the capacity of the phenyl-pyrrolidine derivatives to interact with CyPD in vivo: the compounds will be infused in mice then cardiac mitochondria will be quickly isolated in order to evaluate the potency of our compound to inhibit mPTP opening. 4) The last step of this work will evaluate the cardioprotective effect of the most active compound in mice and rats, in an in vivo model of ischemia-reperfusion. The primary endpoint will be the reduction of infarct size and we will also evaluate the effect of the compound on mitochondrial parameters (improvement of oxidative phosphorylation and susceptibility to mPTP opening).