Analyse et ré allocation des ressources cellulaires pour la production d'une protéine hétérologue ches Bacillus subtilis

par Marwa Zaarour

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Matthieu Jules et de Vincent Fromion.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Structure et Dynamique des Systèmes Vivants , en partenariat avec MICALIS- Microbiologie de l'Alimentation au service de la santé humaine (laboratoire) et de université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 24-08-2015 .


  • Résumé

    Le doctorat est inclus dans un projet européen ITN nommé "protein factory" dont l'objectif est de produire des souches de bactéries super sécrétrices de protéines. Dans ce contexte, l'objectif spécifique du présent doctorat est d'étudier et d'améliorer les capacités de Bacillus subtilis vis-à-vis de la production de protéines hétérologues. Considérées comme des protéines gratuites, la production d'une grande quantité de protéines hétérologues en systèmes bactériens est souvent très compliquée. En effet, il a été démontré par exemple qu'une surexpression de protéines chez E. coli conduisait à une diminution du taux de croissance potentiellement causée par une limitation des ressources cellulaires ou par un effet délétère de l'accumulation de la protéine hétérologue causant un encombrement du cytosol. L'un des objectif majeur du projet de thèse sera d'analyser et de comprendre cet effet "gratuitous protein" chez la bactéries Gram+ Bacillus subtilis. Pour ce faire, nous construirons des souches de B. subtilis exprimant une protéine chimère détectable en ligne et couteuse pour la cellule. Ces protéines seront constituées d'une fusion de la beta-galactosidase et d'une protéine fluorescente. La cassette d'expression sera intégrée au chromosome en copie unique ou multiple. La séquence codant la protéine chimère sera placée en aval d'une séquence d'ADN permettant de forts taux de transcription et de traduction chez B. subtilis. Le niveau de production de la protéine de fusion sera suivi en ligne via la technologie de "Live Cell Array" (LCA) ou par des essais d'activité Beta-galactosidase. L'impact de cette surexpression sur la croissance de Bacillus subtilis sera étudié à travers des croissances dans différents milieux de culture afin de mettre en évidence l'effet "gratuitous protein". Dans une seconde étape du projet, nous ajouterons un tag de dégradation ciblée en position C-terminale de la protéine afin de réaliser une production et une dégradation de la protéine simultanées. L'impact de la dégradation sur la croissance de la cellule permettra ainsi de mieux comprendre l'effet causé par la surproduction d'une protéine hétérologue. Enfin, le modèle métabolique "Resource Balance Analysis" sera utilisé afin d'optimiser les capacités de production hétérologue de Bacillus subtilis.

  • Titre traduit

    Analysis and rerouting of cellular resources for improvement of heterologous protein production in Bacillus subtilis


  • Résumé

    The PhD project is part of the Marie Curie ITN (Innovative Training Network) project "Protein Factory" aiming at obtaining super secretory bacterial strains. Inside this global objective, the main goal of the PhD project is to study and improve the capabilities of B. subtilis toward the production of heterologous proteins. Considered as a gratuitous protein, obtaining high level of production for a heterologous protein in bacteria is often tricky. As shown in E. coli, such a protein production often leads to a decrease of the growth rate due to a disturbance of the normal allocation of the cellular resources or to a deleterious effect caused by an overcrowding of the cytosol. One of the major goal of the PhD project will be to analyze and understand the gratuitous protein effect in the Gram positive bacterium Bacillus subtilis in order to identify potential targets for improving the cell capabilities toward production of heterologous proteins. We will investigate the gratuitous protein effect in B. subtilis by constructing strains expressing an easy to follow and costly (in terms of cellular resources) heterologous chimeric protein made of a translational fusion between a Beta-galactosidase and a green fluorescent protein. An expression cassette will be integrated in the chromosome of Bacillus subtilis (as single or multi copies) according to a rational analysis of the best promoter and loci for obtaining very high level of expression without affecting essential genes in the cell. Correct expression of the protein together with the cell growth capabilities will be followed in microtiterplates using the live cell array technology. Impact of this overexpression on the growth rate of B. subtilis will be evaluated in various growth media in order to evidence and characterize the gratuitous protein effect. We will then implement a system for targeting degradation of the overexpressed protein to decipher the mechanisms of the gratuitous protein effect. After analysis of the mechanisms implied in the gratuitous protein effect, we will use Resource Balance Analysis and synthetic biology strategies in order to improve the capability of B. subtilis towards expression of heterologous proteins.