Barhl2, un nouveau régulateur de l'activité Wnt/β-catenine dans la détermination identitaire de l'organisateur de Spemann

par Elena De Sena Fernandez

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Béatrice Durand.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Structure et Dynamique des Systèmes Vivants , en partenariat avec Signalisation normale et pathologique : de l'embryon aux thérapies innovantes des cancers (laboratoire) , Signalisation et développement neural (equipe de recherche) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2014 .


  • Résumé

    La longue quète pour comprendre la cascade de signalisation Wnt/β-catenine a révélé que la lecture du signal Wnt/β-catenine est fortement dépendante du contexte cellulaire. Dans les embryons de X. laevis Wnt/β-catenine est le signal inducteur pour l'Organisateur de Spemann. On sait peu de choses sur ce qui limite l'activité Wnt dans ce territoire et par conséquent ce qui limite la taille de l'Organisateur. Au cours de la gastrulation, les cellules issues de l'Organisateur de Spemann convergent et génèrent la notocorde qui induit la plaque neurale via la sécrétion des facteurs anti-BMP. Nous avons démontré que le facteur de transcription Barhl2 limite la taille de la notochorde et est pro-apoptotique. Barhl2 limite aussi l'activité Wnt canonique dans le neuroépithélium. J'ai étudié comment Barhl2 contrôle la survie et/ou la détermination identitaire des cellules de la notochorde. Via des techniques d'embryologie, de biologie cellulaire et biochimiques, j'ai évalué l'impact de la déplétion de Barhl2 sur la machinerie apoptotique et sur l'induction de l'Organisateur de Spemann dans des blastula et gastrula de X. laevis. J'ai démontré que la protéine anti-apoptotique MCL-1 favorise la survie des cellules de la notochorde et que la perte de fonction de Barhl2 compense pour la perte de fonction de MCL-1. Par qRT-PCR j'ai montré que la déplétion de Barhl2 ne modifie pas les niveaux d'ARN de mcl-1, ou de toute autre protéine de la cascade apoptotique. En utilisant des techniques ISH et de qRT-PCR j'ai montré que la déplétion de Barhl2 augmente la formation de l'organisateur de la tête et du tronc au détriment du mésoderme ventro-latéral. En utilisant des immunoprécipitations et des test rapporteurs de la voie Wnt/TCF dans des cellules en culture et dans une lignée X. tropicalis transgénique j'ai documenté les interactions biochimiques et fonctionnelles entre Barhl2, Groucho/TLE, Tcf/Lef et le facteur de remodelage de la chromatine la Histone-Deacethylase-1 (HDAC1). Mes résultats révèlent une nouvelle voie de régulation de la voie Wnt/β-catenine canonique qui limite la transcription du réseau de gènes de l'Organisateur de Spemann.

  • Titre traduit

    Barhl2, a new regulator of Wnt/β-catenin activity in fate determination of the Spemann organizer


  • Résumé

    The long lasting search to understand Wnt/β-catenin transduction cascade revealed that the net read out of Wnt/β-catenin signaling is highly dependent on the cellular context. In X. laevis embryos Wnt/β-catenin signaling is the informative signal for the Spemann Organizer induction. However little is known on what limits Wnt activity in this territory and consequently limits the size of the Spemann Organizer. During gastrulation precursor cells emanating from the Spemann Organizer converge medially to give rise to the notochord that patterns the neural plate through the secretion of anti-BMP factors. We previously demonstrated that the transcription factor Barhl2 limits the size of the notochord and promotes apoptosis. Barhl2 also limits Wnt activity in the neuroepithelium. I investigated how Barhl2 controls survival and/or fate determination of the notochord cells. Using embryological, cellular and biochemical approaches I followed the impact of Barhl2 depletion on the apoptotic machinery and on the Spemann Organizer cell fate determination in blastula and gastrula X. laevis embryos. I demonstrated that the anti-apoptotic protein MCL-1 promotes notochord cells survival during gastrulation and that Barhl2 loss-of-function (LOF) compensates for MCL-1 LOF. Using qRT-PCR I showed that Barhl2 depletion does not change RNA levels of mcl-1, or of any other protein of the apoptotic cascade. Using ISH and qRT-PCR I showed that Barhl2 depletion increases formation of both head and trunk organizer at the expense of ventro-lateral mesoderm. Using Immunoprecipitation assays and Wnt/TCF reporter's assays in cultured cells and in a X. tropicalis transgenic line I documented the biochemical and functional interactions between Barhl2, Groucho/TLE, Tcf/Lef and the chromatin remodeling enzyme Histone-Deacethylase-1 (HDAC1) known to interact with Groucho/TLE. My results reveal a new level of regulation of the canonical Wnt/β-catenin pathway that limits transcription of the Spemann Organizer genes network.