Implication des variants d'histone CENP-A et H2A.Z pendant la mitose

par Lorrie Ramos

Projet de thèse en Biologie cellulaire

Sous la direction de Thierry Gautier (edcsv).

Thèses en préparation à Grenoble Alpes , dans le cadre de Chimie et Sciences du Vivant , en partenariat avec CRI IAB - Centre de Recherche Oncologie/Développement - Institute for Advanced Biosciences (laboratoire) et de Equipe 4 - Dimitrov (equipe de recherche) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    Résumé : L'ADN est l'unité de base de la vie pour la plupart des organismes et en particulier les eucaryotes. En effet, il est le support de l'information génétique, permettant leur survie et développement, et doit être transmis fidèlement à la descendance. Pour ce faire, l'ADN est hautement compacté dans le noyau et organisé en une fibre de chromatine qui se condense en chromosome au moment de la division cellulaire. Dans les années 70, il a été démontré que tous les chromosomes eucaryotes consistent en une répétition régulière d'un complexe entre des protéines et l'ADN appelé nucléosome. Hautement conservée entre les espèces, la particule cœur du nucléosome est composée d'un octamère d'histones incluant deux copies de chacune des histones canoniques (H2A, H2B, H3 et H4) autour de laquelle s'enroulent environ 147 paires de bases (pb) d'ADN selon une hélice de 1.7 tours. Étude du rôle du variant d'histone CENP-A dans la mitose : Afin que les chromosomes puissent se séparer équitablement lors de la mitose, une région du chromosome s'est spécialisée dans la fixation des microtubules. C'est le centromère. Cette région se caractérise par une composition particulière des nucléosomes : En lieu et place de l'histone H3, tous les nucléosomes du centromère contiennent une isoforme d'histone également appelée variant : la protéine CENP-A. En 2011 la structure cristallographique du nucléosome contenant CENP-A a été obtenue et analysée (Tachiwana et al., 2011). Il s'avère les structures de CENP-A et H3 sont similaires. Cependant, seulement 121 pb d'ADN sont visibles autour du nucléosome. Notre hypothèse a donc été que les 13 pb d'ADN flexibles seraient la clé de la fonction de CENP-A au niveau de la chromatine centromérique. De plus, il a été démontré que dans la région amino-terminale du variant, l'hélice αN est un tiers plus courte que celle de H3. Par conséquent, nous avons pensé que cette hélice αN de CENP-A pourrait être responsable du rôle spécifique de CENP-A. Récemment nous avons démontré que l'hélice αN du nucléosome CENP-A engendrait une conformation du nucléosome centromérique plus flexible. Cette conformation, spécifique du centromère, s'est avérée essentielle à la ségrégation correcte des chromosomes en mitose. Notre laboratoire a également démontré que l'hélice αN de CENP-A n'était pas nécessaire à la localisation de CENP-A au niveau de la chromatine centromérique (Goutte-Gattat et al., 2013). La déposition de CENP-A au nucléosome s'avère être un prérequis pour l'interaction avec d'autres partenaires du kinétochore. La conformation ouverte du nucléosome centromérique, apportée par les deux extrémités flexibles d'ADN entrant et sortant du nucléosome, serait nécessaire pour l'interaction avec d'autres protéines centromériques. En revanche, les conditions précises de la séquence d'évènements requis pour la formation d'un kinétochore fonctionnel ainsi que la ségrégation des chromosomes restent inconnues (Fachinetti et al., 2015) à ce jour. Outre l'hélice αN, la structure de la boucle L1 de l'histone CENP-A, diffère également de celle de l'histone canonique H3. Cependant, même si ces différences structurales sont bien documentées (Tachiwana et al., 2012) leurs rôles restent largement inconnus. De la même façon, les extrémités amino- et carbxy-terminales de CENP-A semblent permettre l'interaction avec un certain nombre de composants pour former le kinétochore, en particulier les protéines CENP-B et CENP-C. Mon projet de thèse s'inscrit ainsi dans l'étude de la fonction spécifique de la boucle L1 et de l'extrémité carboxy-terminale de l'histone variante CENP-A. Le but sera de comprendre comment se forment les interactions entre le nucléosome CENP-A et les autres protéines du kinétochore. Par la génération et l'expression de mutants déficients pour la boucle L1 dans des cellules invalidées pour le gène CENP-A, on pourra compromettre la fonction assurée par CENP-A. On s'attend ainsi à ce que la déstabilisation des interactions entre CENP-A et ses différents partenaires perturbe l'attachement des microtubules à la chromatine centromérique par l'intermédiaire des multiples interactions kinétochore-histone.

  • Titre traduit

    Implication of histone variants CENP-A and H2A.Z during mitosis


  • Résumé

    DNA is the basic unit of life for most organisms and particularly for eukaryotes. In fact, it supports the genetic information, allowing their survival and development, and it is the vector for its accurate transmission to offspring. To do that, DNA fits into the confines of the nucleus in which it is organized in a chromatin fiber condensing itself in chromosomes during cell division. In the 70's it was established that all eukaryotic chromosomes consist of a regulatory repeating protein DNA complex called the nucleosome. The core particle has a highly conserved structure among species, and is composed of an octamer protein, including two copies each of histones H2A, H2B, H3 and H4, which together with the linker histone, H1, organizes 147 base pairs (bp) of DNA wrapped according to a helix of 1.7 turns around them. So that chromosomes are fairly separated during mitosis, chromosomes have one specific site responsible for the microtubules attachment. This region is characterized by a particular histone composition: meaning that instead of the canonical histones H3, most of all centromeric nucleosomes contain a histone variant called CENP-A. The crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A was solved in 2011 (Tachiwana et al., 2011). It was shown that the overall structure of CENP-A and H3 nucleosomes was quite similar. Although, in the CENP-A nucleosome structure only the 121 bp of DNA are visible around the nucleosome. Our hypothesis 13 bp of DNA at each nucleosomal end display marked flexibility and that this could be the key of the CENP-A function at the centromeric chromatin level. Furthermore, it was demonstrated that in the amino-terminal region of the CENP-A the αN helix was shorter than the one of H3 histone. Therefore, we thought that this αN helix might be responsible for the specific role of CENP-A. Recently, we have demonstrated that the nucleosome CENP-A's αN helix generated a more flexible conformation of the centromeric nucleosome. This conformation, specific to the centromere, proves to be essential to the proper chromosome segregation during mitosis. Our laboratory also demonstrated that the CENP-A αN helix was not requisite for the CENP-A localization at the centromeric chromatin region (Goutte-Gattat et al., 2013). The CENP-A deposition in the nucleosome is a prerequisite to the interaction with other kinetochore partners. The open conformation of the centromeric nucleosome, brought by the two flexible DNA ends (entering and exiting) would be needed for he interaction with other centromeric proteins. However, the precise conditions and the sequence of events required for the formation of a functional kinetochore and the chromosome segregation are still unknown (Fachinetti et al., 2015). Besides the αN helix, the structure of the CENP-A L1 loop, also differs from the canonical histone H3. However, even if the structural differences are well documented (Tachiwana et al., 2012) their functions are barely known. Likewise, the amino-terminal and caorboxy-terminal ends of CENP-A seem to be the source of the interaction with several elements in order to form the kinetochore, and in particular the proteins CENP-B and CENP-C. My thesis project is to study the specific functions of respectively the L1 loop and the carboxy-terminal end of the histone variant CENP-A. The goal is to better understand how are made the interactions between the nucleosome CENP-A and he other kinetochore proteins. Thanks to the generation of expressing deficient mutants for the L1 loop and the C-terminus end in cells invalidated for the CENP-A gene, we should be able to figure out the CENP-A function. That way, we expect that the destabilization of the interactions between CENP-A and it different partners disrupt the attachment of the microtubules to the centromeric chromatin through the multiple interactions kinetochore-histone.