Neutron scattering and methodological developments for the study of the bacterial translocation machinery

par Benjamin Brocco

Projet de thèse en Physique pour les Sciences du Vivant

Sous la direction de Trevor (phys) Forsyth et de Michael Haertlein.

Thèses en préparation à Grenoble Alpes , dans le cadre de Physique , en partenariat avec Institut LAUE LANGEVIN (laboratoire) depuis le 12-09-2014 .


  • Résumé

    Le machinery Sec est essentiel pour la sécrétion et l'insertion des protéines membranaires. La translocation des protéines repose sur l'association de ribosomes en cours de traduction ou de protéines motrices spécialisées ainsi que sur des chaperonnes qui maintiennent les protéines dépliées. Chez la bactérie, les protéines membranaires sont introduites co-traductionnellement alors que les protéines sécrétées traversent la membrane post-traductionnellement grâce à l'ATPase SecA (voir publication récente dans le journal PNAS : Schulze et al. 2014) Nous avons exploité un nouveau system qui permet de sur-exprimer simultanément tous les composant des différents complexes Sec (collarboration avec Drs Schaffitzel and Berger, EMBL-Grenoble). Le plus gros d'entre eux, appelé "holotranslocon" (HTL) contient 7 sous-unités et 34 hélices trans-membranaires pour une masse moléculaire de 250kDA, faisant de lui l'un des plus gros complexe membranaire jamais surexprimé. Ce complexe à la capacité unique de sécréter et insérer les protéines membranaires et sa purification permet d'explorer les aspects encore inconnus de son organisation, activité et dynamique, offrant une possibilité de compréhension des mécanismes de sécrétion et d'insertion des protéines membranaires. Une combinaison de microscopie électronique (Schaffitzel) et diffraction de neutron à petit angle appliquée à l'étude d'HTL a fourni des informations clés sur les bases moléculaire de sa fonction. L'ojectif de ce projet sera de continuer l'exploitation de la diffraction de neutron à petit angle afin d'investiguer la structure de ce complexe. Les expériences permettront de déterminer la localisation moléculaire des partenaires de translocation (ribosome en cours de traduction, SecA)ainsi que celle du substrat. De plus, l'effet de ces partenaires sur la dynamique des composantes protéiques et lipidiques pourra être étudié. Nous pensons que ces expériences seront décisives pour la compréhension des mécanismes d'insertion et intégration des protéines membranaires. Dans ce but, l'étudiant complètera ses connaissances en biologie moléculaire et biochimie des protéines, incluant la production de substrat deutérés. De plus, ces études permettront de promouvoir l'utilisation des neutrons afin d'étudier la structure et la dynamique de gros complexes membranaires, domaines jusqu'à présent hors d'atteinte des études basées sur les électrons et rayons X. En parallèle, un projet est lancé pour approfondir les connaissances dans les méthodes de deutération biomoléculaire et notamment comprendre comment maîtriser le niveau d'intégration des deutérium dans les lipides et acides nucléiques. De plus, une méthode de deutération sélective est mis au point pour permettre de deutérer sélectivement certaines biomolécules.

  • Titre traduit

    Diffraction de neutrons et développements méthodologiques pour l'étude de la machinerie de translocation bactérienne


  • Résumé

    The essential Sec machinery selectively orchestrates the passage of newly synthesized proteins across and into the cytoplasmic and endoplasmic reticular membranes of prokaryotes and eukaryotes. Protein translocation is driven by associated co-translating ribosomes or by specialised energy-transducing factors as well as chaperonnes who keep the pre-protein in a translocation competent state. In bacteria, membrane proteins are threaded into the membrane co-translationally, while secretory proteins are driven across the membrane post-translationally by the motor ATPase SecA - see recent publication in PNAS (Schulze et al. 2014). We have exploited a novel system that allows the simultaneous over-expression of all the components of different Sec complexes (collaboration with Drs Schaffitzel and Berger, EMBL-Grenoble). The largest, called ‘holotranslocon' (HTL) contains 7 subunits, 34 trans-membrane helices and at 250 kDa is the largest membrane protein complex ever assembled. This complex is uniquely capable of both protein-secretion and membrane-insertion and its purification allows the exploration of unknown aspects of its organisation, activity and bioenergetics, providing new insights of the general secretion and membrane protein insertion machinery. A combined electron cryo-microscopy (Schaffitzel) and small angle neutron scattering (SANS) analysis of the HTL has provided key insights into the molecular basis of its function. The objective for the studentship is to continue this exploitation of SANS towards the structural analysis of the Sec complexes. Experiments will be conducted in order to determine the location of the translocation partners (SecA and co-translating ribosome) and respective secretory and membrane protein substrates. In addition, their effects on the structure and dynamics of the protein and lipid components of the Sec channel will be investigated. We anticipate these experiments will prove decisive in the understanding of the mechanism of membrane protein insertion and secretion. In order to achieve this goal, the student will also gain advanced training in molecular biology and biochemistry of membrane proteins, including the production of deuterated proteins and lipids. Moreover, these studies will promote the utilisation of neutrons towards the invaluable structural and dynamic analysis of large membrane protein complexes (in a way that electrons or X-rays cannot). In parallel, a side project will focus on understanding the deuteration of biomolecules, with the emphasis on the partial deuteration of nucleic acids and lipids. Furthermore, a method will be developped to allow the selective deuteration of one classe of biomolecule.