M3S - Développement de l'analyse cellulaire par spectroscopie Raman: application au diagnostic du paludisme et de la leucémie lymphoïde chronique.

par Michaël Fere

Projet de thèse en Sciences - STS

Sous la direction de Olivier Piot.

Thèses en préparation à Reims , dans le cadre de Ecole Doctorale Sciences, Technologies, Santé , en partenariat avec (MEDYC) Matrice Extra-cellulaire et DYnamique Cellulaire (laboratoire) depuis le 04-06-2014 .


  • Résumé

    Pour de nombreuses maladies, le diagnostic par des études morphologiques à l'échelle microscopique est la première étape menant à de nouvelles recherches. Peu d'outils bénéficient actuellement de nouvelles technologies dans la biophotonique "Label free" qui pourrait faciliter et améliorer le diagnostic précoce et le pronostic. Ainsi, associées à l'automatisation de la collecte et de l'analyse des données, ces nouvelles technologies pourraient être des outils puissants pour mieux soigner les patients. De nombreuses études ont montré le potentiel de la spectroscopie vibratoire comme un outil prometteur pour aider les cliniciens régulièrement à établir un diagnostic ou à définir une stratégie thérapeutique. La mise en œuvre concrète de cet outil clinique est une étape critique qui doit répondre aux défis techniques et méthodologiques. Le projet M3S vise à relever ces défis afin de positionner en cytopathologie une station d'analyse de cellules multimodales. Dans ce projet, l'objectif est de développer un outil capable de diagnostiquer la leucémie lymphocytaire chronique (LLC), la première malignité hématologique en Europe, qui affecte les lymphocytes B. Le projet est basé sur un consortium pluridisciplinaire composé de 9 partenaires universitaires et industriels européens. L'outil développé a maintenant atteint la maturité pour être intégré et évalué dans des conditions cliniques. Les frottis sanguins sont effectués dans des conditions cliniques sur une lame de verre, sans coloration. Ces frottis sont ensuite analysés par la machine de M3S suivant une séquence d'étapes totalement automatisés : 1. frottis exploration à faible grossissement de localiser les cellules d'intérêt par analyse morphologique 2. acquisition de spectres Raman sur les cellules sélectionnées 3. qualité des tests pour identifier les valeurs aberrantes spectrales : rapport Signal sur bruit, signal de lymphocytes à rapport de signal de l'hémoglobine (LSHSR), détection de spike, saturation du signal 4. les données de prétraitement à l'aide de la CSEM (Extended multiplicatif Correction du Signal) 5. classement pour l'identification de l'état du patient (sain ou LLC) Les modèles de classification ont été construits en utilisant immunomarquage, comme l'étalon-or. Sous-types de cellules ont été identifiés suite 2 types différents d'immunomarquage, effectué sur les frottis déjà sondés par spectroscopie de Raman « label-free » : CD20 pour marquer les lymphocytes B cas sains et CD2 pour marquer des lymphocytes T et NK sur des cas LLC Enfin, des informations cliniques et biologiques disponibles ont également été intégrés dans la plate-forme M3S. Pour cette étude, nous avons utilisé un total de 3811 cellules : 2128 cellules saines et les cellules LLC 1683. Ces données sont réparties au hasard en deux groupes : un jeu d'apprentissage et un ensemble de validation. Le jeu d'apprentissage est utilisé pour former un modèle de classification supervisée utilisant les moindres carrés partiels – analyse discriminante (PLSDA), quels paramètres sont sélectionnés à l'aide d'une validation croisée interne (Leave one out Patient). Le modèle construit est ensuite testé sur l'ensemble de validation. Afin d'obtenir des résultats robustes, le processus est répété 100 fois. Dans « validation interne », nous avons obtenu une précision moyenne de 88 % pour la classe de cellules sain et 85 % pour la classe de cellules LLC. Dans « external classification », nous avons obtenu une précision de la prévision moyenne de 87 % pour identifier les cellules sain et 84 % pour les cellules LLC. Les résultats obtenus sur la discrimination entre cellules saines et malades montrent le potentiel de la spectroscopie Raman, couplée à une classification supervisée pour le diagnostic du LLC. Le projet de M3S a montré l'intérêt d'une solution de microscopie libre d'étiquette pour le diagnostic de leucémie lymphoïde chronique par rapport aux techniques qui sont actuellement utilisés en hématologie. Cette solution fournit au clinicien avec un accès rapide et simple à lire la réponse sans nécessité de techniques de préparation complexe. Les études à venir portera sur le pronostic du LLC. À cette fin, les marqueurs de Raman seront combinées avec des données biologiques et cliniques utilisant l'algorithme de fusion de données.

  • Titre traduit

    M3S - Development of cell analysis by Raman spectroscopy: application to the diagnosis of malaria and chronic lymphocytic leukemia.


  • Résumé

    For many diseases, diagnosis by morphological studies at the microscopic scale is the first step leading to further research. Few tools currently benefit from new technologies in “label-free” biophotonics which could facilitate and improve both early diagnosis and prognosis. Thus, associated with automating the collection and analysis of data, these new technology could be powerful tools for better care for patients. Many studies have shown the potential of vibrational spectroscopy as a promising tool to help clinicians routinely in establishing a diagnosis or for the definition of a therapeutic strategy. The concrete implementation of this clinical tool is a critical step that needs to answer technical and methodological challenges. The M3S project aims to confront these challenges in order to position in cytopathology a multimodal cell analysis station. In this project, the aim is to develop a tool able to diagnose Chronic Lymphocytic Leukemia (LLC), the first haematological malignancy in Europe, which affects white blood wells of B lymphocyte type. The project is based on a multidisciplinary consortium composed of 9 European academic and industrial partners. The developed tool has now reached the maturity to be integrated and evaluated in routine care clinical settings. Blood smears are performed under clinical conditions on a glass slide, without staining. These smears are then scanned by the M3S machine following a sequence of totally automated steps: 1. Exploration smear at low magnification to locate the cells of interest by morphological analysis 2. Raman spectra acquisitions on the selected cells 3. Quality tests to identify the spectral outliers: Signal to noise ratio, lymphocyte signal to hemoglobin signal ratio (LSHSR), spike detection, signal saturation 4. Data pre-processing using EMSC (Extended Multiplicative Signal Correction) 5. Data classification for the identification of the patient status (Healthy or CLL) The classification models were constructed by using immunostaining, as gold standard. Cell subtypes were identified following 2 different types of immunostaining, performed on the smears previously probed by “label-free” Raman spectroscopy: CD20 to mark B lymphocytes on healthy cases and CD2 to mark T and NK lymphocytes on LLC cases Finally, available biological and clinical information were also integrated into the M3S platform. For this study we used a total of 3811 cells : 2128 healthy cells and 1683 LLC cells. These data are randomly divided into two groups: a training set, and a validation set. The training set is used to train a supervised classification model using Partial Least Squares – Discriminant Analysis (PLSDA), which parameters are selected using an internal cross-validation (Leave one Patient out). The constructed model is then tested on the validation set. In order to obtain robust results, the process is repeated 100 times. We obtained in "internal validation" a mean accuracy of 88% for the class of heathy cells, and 85% for the class of LLC cells. In "external classification", we obtained a mean prediction accuracy of 87% for identifying heathy cells, and 84% for LLC cells. The results obtained on the discrimination between healthy and diseased cells show the potential of Raman spectroscopy coupled with supervised classification for the diagnosis of LLC. The M3S project has shown the interest of a label free microscopy solution for chronic lymphocytic leukaemia diagnosis compared to the techniques that are currently used in haematology. This solution provides the clinician with a quick and simple to read answer with no need for complex preparation techniques. Future studies will focus on the prognosis of LLC. For this purpose, the Raman markers will be combined with biological and clinical information using data fusion algorithm.