Etude de la biosynthèse lipidique au cours de la différentiation kératinocytaire en lien avec l’intégrité de la fonction barrière cutanée

Study of lipid biosynthesis during keratinocyte differentiation in relation to the integrity of the cutaneous barrier function

• Auteur / Autrice : Joudi Bakar
• Direction : Arlette Baillet-Guffroy, Rime Michael-Jubeli
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 22/04/2021
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Lipides : systèmes analytiques et biologiques (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Jury : Président / Présidente : Igor Chourpa
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Carlo Bicchi, Franck Bonnier, Brigitte Closs, Ali Tfayli
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Carlo Bicchi, Franck Bonnier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lipides

Spectroscopie Raman

Épiderme

Différenciation cellulaire

Kératinocytes

Céramides

Mots clés libres

Lipides

Différenciation

Micro-hétérogénéité

NP-HPLC/HR-MSⁿ

Microspectroscopie Raman

Épiderme Reconstruit Humain

Ceramides

Differentiation

Micro-heterogeneity

NP-HPLC/HR-MSⁿ

Raman Microspectroscopy

Reconstructed Human Epidermis.

Résumé

La différenciation des kératinocytes s'accompagne de profondes modifications de la composition lipidique du contenu cellulaire pour former à la fin le ciment intercornéocytaire responsable de la fonction de la barrière cutanée. Les céramides forment la classe lipidique majeure de l’épiderme. Cette classe est très complexe, elle-même se divise en sous-classes qui diffèrent par leur microhétérogénéité structurale. Le but de ce travail a été de développer une méthodologie analytique permettant d’étudier la biosynthèse ces lipides épidermiques au cours de la différenciation kératinocytaire. A ce sujet, deux techniques analytiques ont été utilisés :1) La Chromatographie Liquide à Haute Performance en phase normale couplée à la Spectrométrie de Masse à Haute Résolution NP-HPLC/HR-MSⁿ. Une méthode a été développée afin de séparer les classes lipides de différente polarité en une seule analyse et de caractériser les structures fines des lipides et notamment la micro-hétérogénéité structurale des céramides. 2) La Microspectroscopie Raman qui offre des informations à l’échelle moléculaire et « tissulaire ». Les images spectrales en pseudo-couleurs ont la capacité de mieux suivre l’évolution des lipides au cours de la différenciation et de renseigner sur l’organisation lipidique du Stratum Corneum. Trois modèles cellulaires ont été utilisés pour répondre aux objectifs fixés : 1) Un modèle cellulaire en 2D : pour le suivi de la différenciation dès les étapes précoces (couche basale). Ce modèle a permis de fournir des informations au niveau cellulaire par imagerie Raman. Il a également été utilisé pour mettre en place les premiers développements en NP-HPLC/ HR-MSⁿ. 2) Un modèle d’épiderme reconstruit humain (en 3D) sain, mimant mieux l’environnement in vivo : pour le suivi de la différenciation à partir de Stratum Granulosum (SG) et jusqu’à la formation des multicouches de Stratum Corneum (SC). Ce modèle a permis de fournir des informations au niveau tissulaire (couches épidermiques) et de réaliser toute la caractérisation approfondie des céramides, en tenant compte de l’ensemble des micro-hétérogénéités structurales. 3) Un modèle d’épiderme reconstruit humain (en 3D) altéré : pour illustrer l’adéquation de la méthode en NP-HPLC/HR-MSⁿ afin de mettre en évidence l’impact sur le profil lipidique d’un déficit enzymatique ciblé et d’appréhender l’effet potentiel d’une molécule active. Les résultats majeurs obtenus à partir des travaux expérimentaux sont les suivants : 1) Le développement d’outils analytiques pertinents dans l’élucidation de mélanges lipidiques complexes et leur évolution au niveau cellulaire ou tissulaire. 2) L’application innovante de la Microspectroscopie Raman au niveau de la cellule de kératinocyte (modèle cellulaire en 2D) : plusieurs modifications moléculaires au sein de la cellule ont été observées et notamment entre les jours 9 et 13 de la différenciation indiquant le passage entre SG et SC. 3) L’identification pour la première fois dans la littérature de deux nouvelles sous-classes de céramides (1-O-E (EO) Cer et A-1-O (EO) Cer) dans le modèle d’épiderme reconstruit humain sain mais également dans le SC humain, à partir des données fournies par la méthode développée en NP-HPLC/HR-MSⁿ. 4) La mise en évidence d’une perturbation du profil lipidique à maturation sur un modèle d’épiderme reconstruit humain altéré. L’ensemble de ces résultats a pu offrir une meilleure compréhension du métabolisme lipidique lors de la maturation des kératinocytes, de façon très détaillée au niveau moléculaire, qui permettrait d'appréhender de façon plus raisonnée les perturbations de la fonction barrière cutanée, physiologiques ou pathologiques.

The keratinocytes differentiation is accompanied by profound modifications of the lipid composition of the cell contents to form at the terminal differentiation stage the intercorneocyte cement (lipid matrix) responsible for the skin barrier function. Ceramides are the major lipid class of the epidermis. This class is very complex, it self is divided into subclasses which differ in their structural micro-heterogeneity. The aim of this work was to develop an analytical methodology to study the biosynthesis of these epidermal lipids during keratinocyte differentiation. On this subject, two analytical techniques were used: 1) Normal Phase-High Performance Liquid Chromatography coupled with High Resolution Mass Spectrometry NP-HPLC/HR-MSⁿ. A method has been developed in order to separate the lipid classes of different polarity in a one single run and to characterize the fine structures of lipids in particular the structural micro-heterogeneity of ceramides. 2) Raman Microspectroscopy, which provides information at levels of molecules and of tissues. Pseudo-color spectral images have the ability to better follow the evolution of lipids during differentiation and to provide information on the lipid organization of the Stratum Corneum. Three cellular models were used to achieve our objectives: 1) A 2D cell model: for monitoring the differentiation from the early stages (basal layer). This model made it possible to provide information at the cellular level by Raman imaging. It was also used to establish the first developments in NP-HPLC/HR-MSⁿ. 2) A healthy 3D reconstructed human model of epidermis, better mimicking the environment in vivo: for monitoring differentiation from Stratum Granulosum (SG) and up to the formation of Stratum Corneum (SC) multilayers. This model allowed to provide information at the tissue level (epidermal layers). In addition, it is on this model that all the in-depth characterization of ceramides was carried out, taking into account all the structural heterogeneities. 3) An altered 3D human reconstructed epidermis model: to illustrate the suitability of the NP-HPLC/HR-MSⁿ method in order to highlight the impact on the lipid profile of a targeted enzymatic deficit and to understand the potential effect of an active molecule. The major results obtained from the experimental work are as follows: 1) The development of relevant analytical tools in the elucidation of complex lipid mixtures and their evolution at the cellular or tissue level. 2) The innovative application of Raman Microspectroscopy at the level of the keratinocyte cell (2D cell model): several molecular modifications within the cell were observed and in particular between days 9 and 13 of differentiation indicating the passage between SG and SC. 3) The identification for the first time in the literature of two new subclasses of ceramides (1-OE (EO) Cer and A-1-O (EO) Cer) in the healthy human reconstructed epidermis model but also in the human SC, from data provided by the developed method in NP-HPLC/HR-MSⁿ. 4) Demonstration of a disruption of the lipid profile at maturation on an altered reconstructed human epidermis model. All of these results have been able to provide a better understanding of lipid metabolism during keratinocyte maturation, in very detail at the molecular level, which would allow a more reasoned understanding of the physiological or pathological disturbances of the skin barrier function.