Mécanismes d’interactions entre les flavonols et la lipase recombinante CpLIP2 de Candida parapsilosis : approches enzymatique et biophysique

Mechanisms of interactions between flavonols and recombinant CpLIP2 lipase from Candida parapsilosis : enzymatic and biophysical approaches

• Auteur / Autrice : Ruba Nasri
• Direction : Christian Jay-Allemand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologie et microbiologie
• Date : Soutenance le 26/11/2019
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : GAIA (Montpellier ; École Doctorale ; 2015-...)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Ingénierie des Agro-Polymères et Technologies Emergentes (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Pascal Gantet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christian Jay-Allemand, Pascal Gantet, Kevin Gould, Carine Le Bourvellec, Luc Bidel, Benoît Saint-Pierre
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Kevin Gould, Carine Le Bourvellec

Mots clés

Mots clés contrôlés

Flavonoïdes

Candidose

Hydroxylation

Lipases

Mots clés libres

Lipase recombinant CpLIP2

Flavonols

Hydroxylation

Inhibition

Quenching de fluorescence

Tryptophan

Recombinant CpLIP2 Lipase

Flavonols

Hydroxylation

Inhibition

Quenching of fluorescence

Tryptophan

Résumé

Cette thèse de doctorat vise à étudier les mécanismes d'interactions entre la lipase / acyltransférase CpLIP2 recombinante de Candida parapsilosis et 4 flavonols qui se distinguent par un degré d’hydroxylation croissant sur le cycle B (galangine, kaempferol, quercétine et myricétine). Notre stratégie a intégré 3 approches complémentaires : enzymatique, biophysique et le docking moléculaire. Tout d'abord, les effets inhibiteurs des 4 flavonols et de la tétrahydrolipstatine (THL) en tant qu'inhibiteur de référence des lipases ont été étudiés en déterminant l’activité d’hydrolyse d’oléate d’éthyle en tant que réaction modèle. Deuxièmement, le quenching de la fluorescence intrinsèque du tryptophane de CpLIP2 a été étudiée à l'aide de la théorie de Stern-Volmer afin de déterminer les paramètres thermodynamiques impliqués dans les forces de liaison entre la lipase CpLIP2 et les flavonols testés ou le THL. Troisièmement, la zone d'accessibilité au solvant des résidus de tryptophane de la lipase CpLIP2 a été estimée par le docking moléculaire et la modélisation structurelle. Le mode de liaison entre le modèle 3D de CpLIP2 et les inhibiteurs a été prédit. Quatrièmement, nous avons exploré l’effet inhibiteur de l’activité hydrolytique de CpLIP2 lorsque deux flavonols sont mélangés à des concentrations équivalentes. Cinquièmement, les performances de la méthode fluorométrique ont été conduites en utilisant le 4-méthyl-ombelliferyl butyrate, un substrat fluorescent, afin de développer un test de criblage rapide et sensible des inhibiteurs. Enfin, la liaison de la sonde fluorescente hydrophobe 1-aminoanthracène (1-AMA) à la lipase CpLIP2 a été étudiée afin de mieux comprendre les interactions entre les ligands hydrophobes avec la protéine et d’identifier les changements structurels de la conformation. Ces travaux ont révélé le rôle important des résidus de Trp dans l’établissement des liaisons moléculaires entre les flavonols et la lipase. Cette étude a confirmé que tous les flavonols ont des effets inhibiteurs et que les plus forts ont été attribués au kaempferol contenant un seul groupe hydroxyle sur le cycle B en 4’-C. Le quenching de la fluorescence par les flavonols a démontré une relation étroite avec leurs effets sur l'activité hydrolytique de CpLIP2. Ces résultats nous ont incités à mettre au point un test HTS de criblage pour de nombreux inhibiteurs, basé sur le quenching de la fluorescence Trp. En outre, l'inhibition de la lipase/acyltransférase CpLIP2 recombinante de C. parapsiolosis a été considérée comme un modèle clé pour la découverte d'un nouveau médicament antifongique et une cible thérapeutique potentielle pour la candidose.

This PhD thesis aims to investigate the mechanisms of interactions between the recombinant CpLIP2 lipase/acyltransferase from Candida parapsilosis and 4 flavonols characterized by an increasing degree of hydroxylation in B-ring (galangin, kaempferol, quercetin and myricetin). Our strategy has integrated 3 complementary approaches: enzymatic, biophysical and molecular docking. First, the inhibition effects of the 4 flavonols and tetrahydrolipstatin (THL) as reference inhibitor for lipases, were investigated using ethyl oleate hydrolysis as the model reaction. Second, the quenching of CpLIP2 intrinsic tryptophan fluorescence was studied using the Stern-Volmer theory to determine the thermodynamic parameters involved in the binding forces between the CpLIP2 lipase and flavonols tested beside the THL. Third, solvent accessibility area of tryptophan residues of CpLIP2 lipase were estimated by molecular docking and structural modelling, and the mode of binding between 3D model of CpLIP2 and the inhibitors were predicted. Fourth, we explored the inhibitory effect on the hydrolytic activity of CpLIP2 when two flavonols are mixed at equivalent concentrations. Fifth, the performance of fluorometrical method was conducted using the fluorogenic substrate 4-methyl-umbelliferyl butyrate in order to develop a rapid and sensitive screening test of inhibitors. Last, the binding of hydrophobic fluorogenic probe 1-aminoanthracene (1-AMA) to CpLIP2 lipase was investigated, in order to better understand both the interactions between hydrophobic ligands with the protein and to identify the changing of structural conformation. This work revealed the important role of Trp residues in the establishment of molecular bonds between flavonols and the lipase. It was confirmed that all flavonols have inhibitory effects and the strongest ones was attributed to kaempferol holding hydroxyl group on B-ring in 4’-C. The quenching of fluorescence by flavonols demonstrated a tight relationship with their effects on CpLIP2 hydrolytic activity. These results encouraged us to develop a screening test of HTS for numerous inhibitors based on the quenching of Trp fluorescence. In addition, the inhibition of recombinant CpLIP2 lipase/acyltransferase from C. parapsiolosis was considered as a key model for novel antifungal drug discovery and a potential therapeutic target for candidiasis.