Développement d’outils bio-informatiques décisionnels en médecine vétérinaire : application au modèle Tenacibaculum, agent pathogène de poissons marins

Bioinformatics tools for decisional help in veterinary medecine : fish pathogens of the Tenacibaculum genus as models

• Auteur / Autrice : Sébastien Bridel
• Direction : Eric Duchaud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 29/06/2020
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Virologie et immunologie moléculaire (VIM) - Virologie et Immunologie Moléculaires
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université de Versailles-Saint-Quentin-en-Yvelines (1991-....)
• Jury : Président / Présidente : Michel-Yves Mistou
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Frédérique Le Roux, Xavier Bailly, François Thomas, Pierre Brezellec
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Michel-Yves Mistou, Frédérique Le Roux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Tenacibaculum

Maladies animales -- Épidémiologie

Aquaculture

Spectrométrie de masse

Bioinformatique

Mots clés libres

Tenacibaculum

Épidémiologie

Bioinformatique

Tenacibaculum

Épidémiologie

Bioinformatics

Résumé

Le genre Tenacibaculum (famille des Flavobacteriaceae, phylum Bacteroidetes), proposé en 2001 par Suzuki et al., comprend aujourd’hui 28 espèce valides. Ces bactéries sont exclusivement retrouvées dans les milieux marins, libres ou associées à des organismes tels que les poissons, les macroalgues et les invertébrés. Huit espèces sont pathogènes pour les poissons et essentiellement isolées dans des élevages. Ces bactéries sont à l’origine de maladies aux symptômes similaires collectivement désignées sous le nom de ténacibaculoses. L’identification basée sur des caractères phénotypiques n’est pas suffisamment discriminante et ne permet généralement pas d’identifier l’espèce responsable de la pathologie lors d’épisodes infectieux dans les élevages. L’objectif central de mon projet doctoral était de comprendre la prévalence de ces bactéries, notamment à travers le développement d’outils bioinformatiques décisionnels en médecine vétérinaire. En premier lieu, j’ai vérifié la taxonomie actuelle de l’ensemble du genre (espèces décrites et génomes publiés) à l’aide d’un ensemble de méthodes de phylogénomique comme l’Average Nucleotide Identity. Ce travail a permis de nous intéresser à un groupe d’espèces très proches, T. dicentrarchi, T. finnmarkense et T. piscium et a mis en évidence un exemple illustrant la théorie émise par Habib et al. (2014) soutenant l’idée d’une évolution parallèle de la pathogénicité ainsi que des acquisitions multiples de facteurs de virulence au sein du genre Tenacibaculum. Il semble également qu’il existe des phénomènes de convergence évolutive pour certains facteurs de virulence (gènes totalement différents mais codant pour la même fonction). J’ai ensuite développé une méthode d’identification et de typage d’isolats bactériens appartenant au genre Tenacibaculum par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Cette méthode a comme principaux avantages d’être fiable, rapide et peu coûteuse. Pour développer la méthode d’identification, les spectres des références des souche types de la quasi-totalité des espèces du genre Tenacibaculum ont été obtenus L’identification d’un isolat de terrain repose dès lors sur une quantification de la ressemblance entre l’empreinte spectrale de l’échantillon et les empreintes spectrales de références. Afin de développer une méthode de typage des souches à l'intérieur de l’espèce T. maritimum, nous avons en premier lieu utilisé les génomes complets de 25 souches (dont 22 obtenus dans le cadre de ce projet) afin d’évaluer la diversité intra-spécifique. La méthode de MALDI-typage développée repose sur l’utilisation de biomarqueurs (protéines ribosomiques polymorphes). J’ai cherché à exploiter au maximum le potentiel de la spectrométrie de masse MALDI-TOF en combinant les informations tirées des génomes avec les empreintes spectrales. J’ai choisi de définir un MALDI-Type (MT) comme étant une combinaison unique de 9 biomarqueurs en m’inspirant de la technique de MLST. Dans une collection de 130 isolats de terrain, nous avons ainsi pu identifier 20 MT qui se regroupent en 4 MALDI-groupes distincts. Enfin, j’ai développé une application web dénommée MALDIquantTypeR intégrant : la base de données de référence pour les espèces appartenant au genre Tenacibaculum, les outils d’identification ainsi que l’outil de typage dédié à l’espèce T. maritimum développés dans le cadre de ce projet. Il doit permettre à des chercheurs parfois géographiquement éloignés d’analyser directement des données brutes issues d’un spectromètre de masse. Nous pensons que la spectrométrie de masse MALDI-TOF peut être utilisée à la fois dans le cadre d’études épidémiologiques à large échelle, mais également être intégrée dans le diagnostic vétérinaire de routine. Ce projet a fait appel à différentes approches reposant essentiellement sur le séquençage et l’analyse de génomes complets, ainsi que sur la protéomique (spectrométrie de masse MALDI-TOF).

The genus Tenacibaculum (family Flavobacteriaceae, phylum Bacteroidetes) was proposed in 2001 by Suzuki et al. and currently includes 28 valid species. These bacteria are found exclusively in marine environments, either free or associated with organisms such as fish, macroalgae and invertebrates. Eight species are pathogenic to fish and are mainly isolated in farms. These bacteria cause diseases with similar symptoms that are collectively referred to as tenacibaculosis. Identification based on phenotypic characteristics is not sufficiently discriminating and generally does not make it possible to identify the species responsible for the pathology during infectious episodes in farms. The central objective of my doctoral project was to understand the prevalence of these bacteria, particularly through the development of bioinformatics decision-making tools in veterinary medicine. First, I developed upon the important sequencing effort initiated by the team before my arrival on bacteria belonging to the genus Tenacibaculum. I verified the current taxonomy of the entire genus (described species and published genomes) using a set of phylogenomic methods such as the Average Nucleotide Identity. This work has allowed us to focus on a group of closely related species, T. dicentrarchi, T. finnmarkense and T. piscium, and has highlighted an example illustrating the theory put forward by Habib et al (2014) supporting the idea of a parallel evolution of pathogenicity as well as multiple acquisitions of virulence factors within the genus Tenacibaculum. It also seems that evolutionary convergence phenomena have taken place for some virulence factors (i.e., totally different genes but encoding the same function). I then developed a method for identifying and typing bacterial isolates belonging to the genus Tenacibaculum using MALDI-TOF mass spectrometry. The main advantages of this method are its reliability, speed and low cost. To develop the identification method, the reference spectra of the type strains of most (24 out of 28) species of the genus Tenacibaculum were obtained. The identification of a field isolate is therefore based on a quantification of the similarity between the spectral footprint of the sample and the reference spectral footprints. In order to develop a typing method for strains within the T. maritimum species, we first used the complete genomes of 25 strains (including 22 obtained in this project) to assess intraspecific diversity. The MALDI-typing method developed is based on the use of biomarkers (polymorphic ribosomal proteins). I have sought to maximize the potential of MALDI-TOF mass spectrometry by combining information from genomes with spectral fingerprints. I chose to define a MALDI-Type (MT) as a unique combination of 9 biomarkers based on the MLST technique. In a collection of 130 field isolates, we were able to identify 20 MT that are grouped into 4 distinct MALDI-groups. Finally, I developed a web application called MALDIquantTypeR that integrates: the reference database for species belonging to the genus Tenacibaculum, the identification tools as well as the typing tool dedicated to the species T. maritimum developed as part of this project. It should allow geographically distant researchers to directly analyze raw data from any mass spectrometer. We believe that MALDI-TOF mass spectrometry can be used both in large-scale epidemiological studies and in routine veterinary diagnosis. This project used different approaches based mainly on sequencing and analysis of complete genomes, as well as proteomics (MALDI-TOF mass spectrometry). The development of analytical tools has also required bioinformatics approaches and programming.