Développement de tests diagnostiques par détection d'ADN extracellulaire

Development of diagnostic tests by extracellular DNA detection

• Auteur / Autrice : Rita Tanos
• Direction : Alain Thierry, Mona Diab-Assaf
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 25/11/2019
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Recherche en Cancérologie (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Muriel Mathonnet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alain Thierry, Mona Diab-Assaf, Muriel Mathonnet, Sébastien Salas, Lynnette Fernandez-Cuesta, Florence Le Calvez-Kelm, Didier Tousch, Stanislas Du Manoir
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sébastien Salas, Lynnette Fernandez-Cuesta

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cancer

Tests de diagnostic rapide

ADN

Mots clés libres

ADN extracellulaire

Tests diagnostiques

Cancer

Détection précoce

Test génétique préimplantatoire

Extracellular DNA

Diagnostic tests

Cancer

Early detection

Preimplantation genetic testing

Résumé

Après sa découverte en 1948, l'ADN circulant (ADNcir) a été étudié dans divers domaines. Il est devenu un biomarqueur émergent, en particulier en oncologie, un domaine dans lequel plusieurs travaux ont récemment cherché à étudier son intérêt dans le dépistage et la détection précoce du cancer. La première partie de ma thèse a été consacrée à l’étude des caractéristiques quantitatives et structurelles de l’ADNcir, en prenant en compte son origine (ADNcir nucléaire et mitochondrial) et sa structure (fragmentation et profil de taille), pour le dépistage et la détection précoce du cancer. Deux paramètres, le Ref A 67 (concentration totale d’ADNcir nucléaire) et le MNR (Rapport entre la concentration de l’ADNcir mitochondrial et nucléaire), ont été quantifiés par q-PCR dans un modèle murin puis validés dans les milieux des cellules en culture pour évaluer leur potentiel à discriminer un état sain d’un état cancéreux. Ces deux paramètres ont été quantifiés chez l’Homme, en prenant en compte d'autres paramètres quantitatifs et structurels de l'ADNcir, après réajustement en fonction de l’âge, dans le plasma de 289 individus sains, 99 individus à risque de cancer colorectal (CCR) et 983 patients atteints de CCR (n = 791), de cancer du sein (n = 169) et d'autres cancers (hépatocellulaire, pancréatique, ovarien et lymphome) (n = 23). Par une approche d’apprentissage automatique, nous avons combiné ces différents paramètres dans un modèle de prédiction en utilisant des arbres de décision pour la classification des patients sains et cancéreux. Nous avons obtenu des résultats très encourageants, en particulier pour les cancers de stades précoces. Cette méthode semble prometteuse pour une détection précoce et non invasive du cancer. L'ajout d'autres biomarqueurs, comme le profil de taille ou le profil de méthylation de l'ADNcir, pourrait encore en augmenter le potentiel. La deuxième partie de ma thèse a été consacrée à l’étude de la relation entre la quantité d’ADN extracellulaire d’origine nucléaire et mitochondriale dans le milieu de culture d’embryons, et la qualité de ces embryons lors d’une fécondation in vitro (FIV). En effet, il a été montré qu’un embryon libère de l’ADN extracellulaire dans le milieu de culture lors d’une FIV, et que cet ADN pourrait être un biomarqueur prédictif de la qualité de l’embryon et servir comme test génétique préimplantatoire (PGT) non invasif. Nous avons détecté le gène SRY dans le milieu de culture afin de déterminer le sexe de l’embryon, ce qui constitue une information importante dans les cas des maladies génétiques liées au sexe. Nous avons également entrepris de détecter la présence de la mutation Delta F508 du gène CFTR responsable de la mucoviscidose par analyse de l’ADN extracellulaire issu d’embryons à risque, afin d’évaluer son potentiel en tant que PGT non invasif.

After its discovery in 1948, circulating DNA (cirDNA) was studied in various fields. It has become an emerging biomarker, particularly in oncology, and several studies have recently sought to investigate its interest in cancer screening and early detection. The first part of my thesis was devoted to the study of the quantitative and structural characteristics of cirDNA, taking into account its origin (nuclear and mitochondrial cirDNA) and its structure (fragmentation and size profile), for the screening and early detection of cancer. Two cirDNA parameters, the Ref A 67 (total nuclear cirDNA concentration) and the MNR (Mitochondrial to Nuclear Ratio), were quantified by q-PCR in a mouse model and further validated in cell culture media to assess their potential to discriminate between a healthy and a cancerous state. These two variables were evaluated by taking into account other quantitative and structural parameters of cirDNA, after age adjustment, in the plasma of 289 healthy individuals, 99 individuals at risk of colorectal cancer (CRC) and 983 patients with CRC (n = 791), breast cancer (n = 169) and other cancers (hepatocellular, pancreatic, ovarian and lymphoma) (n = 23). Through a machine learning approach, we combined these different parameters into a prediction model using decision trees for the classification of healthy and cancer patients. We have obtained very encouraging results, especially for early-stage cancers. This method seems promising for early and non-invasive cancer detection. The addition of other biomarkers such as the size profile of the cirDNA or the detection of methylation markers could further increase its potential.The second part of my thesis was devoted to the study of the relationship between the quantity of extracellular DNA of nuclear and mitochondrial origin in the embryo culture medium, and the quality of these embryos during in vitro fertilization (IVF). It has been shown that an embryo releases extracellular DNA into the culture medium during IVF, and that this DNA could be a predictive biomarker of embryo quality and thus be used as a non-invasive preimplantation genetic test (PGT). We detected, as well, the SRY gene in the culture medium to determine the sex of the embryo, which is an important information in the case of gender-related genetic disorders. We also tried to detect the presence of the Delta F508 mutation of the CFTR gene responsible for cystic fibrosis, by analyzing extracellular DNA from high-risk embryos to assess its potential as a non-invasive PGT.