Caractérisation structurale et fonctionnelle de l’ARN long non codant MEG3

Structure-functional studies on lncRNA MEG3

• Auteur / Autrice : Tina Uroda
• Direction : Marco Marcia
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 09/05/2019
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : European molecular biology laboratory (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Claire Vourc'h
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marco Marcia, Reini Luco, Janosch Hennig
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Alberto Inga, Maite Huarte

Mots clés

Mots clés contrôlés

Épigénétique

ARN non codants

Mots clés libres

Structure d’ARN

Épigénétique

Biologie structurale intégrée

Long non coding RNAs

RNA structure

Epigenetics

Integrated structural biology

Résumé

Les ARNs long non codants (ARNlnc) jouent un rôle clé dans les processus cellulaires vitaux, notamment le remodelage de la chromatine, la réparation de l'ADN et la traduction. Cependant, la taille et la complexité des ARNlnc présentent des défis sans précédent pour les études moléculaires mécanistiques, de sorte qu'il s'est avéré difficile jusqu'à présent de relier l'information structurelle à la fonction biologique pour les ARNlnc.Le gène 3 humain exprimé maternellement (de l’anglais "maternally expressed gene 3", MEG3), est un ARNlnc abondant, soumis à empreinte parentale et épissé alternativement. Pendant l'embryogenèse, MEG3 contrôle les protéines Polycomb, régulant la différenciation cellulaire, et dans les cellules adultes, MEG3 contrôle p53, régulant la réponse cellulaire aux stress environnementaux. Dans les cellules cancéreuses, MEG3 est régulé négativement, mais la surexpression ectopique de MEG3 réduit la prolifération incontrôlée, ce qui prouve que MEG3 agit comme un suppresseur de tumeur. Les données suggèrent que les fonctions de MEG3 pourraient être régulées par la structure de MEG3. Par exemple, on pense que MEG3 se lie directement aux protéines p53 et Polycomb. De plus, les différents variants d'épissage de MEG3, qui comprennent différents exons et possèdent ainsi des structures potentiellement différentes, présentent des fonctions différentes. Enfin, la mutagenèse par délétion, basée sur une structure de MEG3 prédit in silico, a permis d’identifier un motif MEG3 supposé structuré impliqué dans l'activation de p53. Cependant, au début de mes travaux, la structure expérimentale de MEG3 était inconnue.Pour comprendre la structure et la fonction de MEG3, j'ai utilisé des sondes chimiques in vitro et in vivo pour déterminer la structure secondaire de deux variants humains de MEG3 qui diffèrent par leurs niveaux d'activation de p53. À l'aide d'essais fonctionnels dans les cellules et de mutagenèse, j'ai systématiquement analysé la structure de MEG3 et identifié le noyau activant p53 dans deux domaines (D2 et D3) qui sont conservés structuralement dans les variants humains et conservés dans l’évolution chez les mammifères. Dans D2-D3, les régions structurales les plus importantes sont les hélices H11 et H27, car dans ces régions, j’ai pu supprimer l'activation de p53 grâce à des mutations ponctuelles, un degré de précision jamais atteint pour les autres ARNlnc jusqu’ici. J'ai découvert de manière surprenante que H11 et H27 sont reliés par des boucles connectées l’une à l’autre (de l’anglais "kissing loops") et j'ai confirmé l'importance fonctionnelle de ces interactions de structure tertiaire à longue distance par mutagenèse compensatoire. Allant au-delà de l’état de l’art, j'ai donc essayé de visualiser la structure 3D d’une isoforme de MEG3 longue de 1595 nucléotides, par diffusion de rayons X à petit angle (SAXS), microscopie électronique (EM) et microscopie à force atomique (AFM). Alors que le SAXS et l’EM sont limités par des défis techniques actuellement insurmontables, l’imagerie par AFM m’a permis d’obtenir la première structure 3D à basse résolution de MEG3 et de révéler son échafaudage tertiaire compact et globulaire. Plus remarquable encore, les mêmes mutations qui perturbent la connexion entre les «boucles» H11-H27 et qui inhibent la fonction de MEG3, perturbent aussi la structure 3D de cet ARNlnc, fournissant ainsi le premier lien direct entre la structure 3D et la fonction biologique pour un ARNlnc.Sur la base de mes découvertes, je peux donc proposer un mécanisme de l’activation de p53 basé sur la structure de MEG3, avec des implications importantes pour la compréhension de la cancérogenèse. Plus généralement, mes travaux prouvent que les relations structure-fonction des ARNlnc peuvent être disséquées avec une grande précision et ouvrent la voie à des études analogues visant à obtenir des informations mécanistes pour de nombreux autres ARNlnc d’importance médicale.

Long non-coding RNAs (lncRNAs) are key players in vital cellular processes, including chromatin remodelling, DNA repair and translation. However, the size and complexity of lncRNAs present unprecedented challenges for mechanistic molecular studies, so that connecting structural information with biological function for lncRNAs has proven difficult so far.Human maternally expressed gene 3 (MEG3) is an abundant, imprinted, alternatively-spliced lncRNA. During embryogenesis MEG3 controls Polycomb proteins, regulating cell differentiation, and in adult cells MEG3 controls p53, regulating the cellular response to environmental stresses. In cancerous cells, MEG3 is downregulated, but ectopic overexpression of MEG3 reduces uncontrolled proliferation, proving that MEG3 acts as a tumour suppressor. Evidence suggests that MEG3 functions may be regulated by the MEG3 structure. For instance, MEG3 is thought to bind p53 and Polycomb proteins directly. Moreover, different MEG3 splice variants, which comprise different exons and thus possess potentially different structures, display different functions. Finally, deletion mutagenesis based on a MEG3 structure predicted in silico identified a putatively-structured MEG3 motif involved in p53 activation. However, at the beginning of my work, the experimental structure of MEG3 was unknown.To understand the MEG3 structure and function, I used chemical probing in vitro and in vivo to determine the secondary structure maps of two human MEG3 variants that differ in their p53 activation levels. Using functional assays in cells and mutagenesis, I systematically scanned the MEG3 structure and identified the p53-activating core in two domains (D2 and D3) that are structurally conserved across human variants and evolutionarily conserved across mammals. In D2-D3, the most important structural regions are helices H11 and H27, because in these regions I could tune p53 activation even by point mutations, a degree of precision never achieved for any other lncRNA to date. I surprisingly discovered that H11 and H27 are connected by “kissing loops”, and I confirmed the functional importance of these long-range tertiary structure interactions by compensatory mutagenesis. Going beyond state-of-the-art, I thus attempted to visualize the 3D structure of a 1595-nucleotide long MEG3 isoform by small angle X-ray scattering (SAXS), electron microscopy (EM), and atomic force microscopy (AFM). While SAXS and EM are limited by currently-insurmountable technical challenges, single particle imaging by AFM allowed me to obtain the first low resolution 3D structure of MEG3 and reveal its compact, globular tertiary scaffold. Most remarkably, functionally-disrupting mutations that break the H11-H27 “kissing loops” disrupt such MEG3 scaffold, providing the first direct connection between 3D structure and biological function for an lncRNA.Based on my discoveries, I can therefore propose a structure-based mechanism for p53 activation by human MEG3, with important implications in understanding carcinogenesis. More broadly, my work serves as proof-of-concept that lncRNA structure-function relationships can be dissected with high precision and opens the field to analogous studies aimed to gain mechanistic insights into many other medically-relevant lncRNAs.