Identification et caractérisation de nouveaux substrats de la kinase Greatwall

Identification and characterization of new Greatwall kinase substrates

• Auteur / Autrice : Lena Sundermann
• Direction : Anna Castro, Thierry Lorca
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 02/07/2018
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche de Biochimie Macromoléculaire (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Dimitris Xirodimas
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Anna Castro, Thierry Lorca, Dimitris Xirodimas, Anne Royou, Lionel Pintard
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne Royou, Lionel Pintard

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines kinases

Protéines phosphatases

Phosphatases

Mitose

Kinases dépendantes des cyclines

Mots clés libres

Greatwall

Substrats des kinases

Mitose

Pp1

Régulation des phosphatases

Greatwall

Kinase substrates

Mitosis

Pp1

Phosphatase regulation

Résumé

La Division mitotique est une phase essentielle du cycle cellulaire qui assure la répartition correcte du contenu génétique. La mitose implique une réorganisation cellulaire profonde qui est principalement induite par une phosphorylation massive de protéines. Cette phosphorylation a lieu grâce à un équilibre fin entre kinases et phosphatases. À l'entrée mitotique, la phosphorylation protéique est induite par l'activation de la kinase cycline B/CDK1 et par l'inhibition de la phosphatase PP2A-B55. Résultats de notre et d'autres laboratoires ont récemment découvert une nouvelle voie essentielle pour moduler la phosphatase PP2A-B55 pendant la transition G2-M. Cette voie inclut la kinase Greatwall (GW) et ses substrats Arpp19 et ENSA. À l'entrée mitotique GW est activé et phosphoryle Arpp19 et ENSA les convertissant en inhibiteurs puissants de PP2A-B55. Étonnamment, aucun autre substrat de GW n'a été identifié jusqu'ici. Cependant, plusieurs éléments suggèrent fortement de nouveaux rôles de GW indépendamment de Arpp19 et de ENSA. L'objectif principal de ce travail était l'identification de nouveaux substrats de GW. À cette fin, j'ai utilisé plusieurs approches, y compris: (1) fractionnement biochimique des lysats de cellules ou des extraits d'oeufs de Xenopus combiné suivi d’une phosphorylation in vitro avec une kinase GW recombinante, (2) SILAC/phosphoproteomique des lysats de cellules exprimant différents niveau de GW, (3) Co-Immunoprecipitation, (4) BioID, et (5) une approche dirigée candidat. Les résultats de la phosphorylation in vitro ont révélé la présence de deux bandes de phosphorylation intéressantes qui sont actuellement analysées. Les deux approches SILAC/phosphoprotéinique et interactome ont révélé l'enrichissement des protéines impliquées dans la régulation post-transcriptionnelle de l'expression génique et des processus liés à l'ARN, une fonction physiologique déjà décrite pour cette voie chez la levure. Enfin, nous avons directement étudié la phosphorylation présumée par GW de trois candidats connus pour être impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire. Bien que phosphorylées in vitro par GW, nous n’avons pu identifier le site de phosphorylation que dans l'une de ces trois protéines. Cette protéine, qui correspond à un inhibiteur de phosphatase, semble contrôler la sortie mitotique par la modulation de la déphosphorylation protéique. Un mutant non phosphorylable de cet inhibiteur induit une sortie mitotique perturbée avec une déphosphorylation ralentie des substrats mitotiques et une altération de la dégradation de la cycline B. J’ai pu attribuer ce défaut à une association perturbée de l'inhibiteur avec la phosphatase et, par conséquent, à un timing aberrant de l'inhibition de la phosphatase. Enfin, j'ai identifié le site de phosphorylation par GW comme le facteur clé contrôlant cette association. En résumé, j'ai identifié dans cette étude un nouveau substrat de GW contrôlant l'activité de la phosphatase essentielle pour une division mitotique correcte.

Mitotic division is an essential phase of the cell cycle that ensures the correct repartition of the genetic content. Mitosis involves profound cellular reorganization that is mostly induced by massive protein phosphorylation. This phosphorylation is achieved thanks to the fine-tuning of the balance between kinases and phosphatases. At mitotic entry, protein phosphorylation is induced by the activation of the master kinase Cdk1-cyclin B and the inhibition of the phosphatase PP2A B55. Previous results from our and other laboratories recently discovered a new pathway essential to modulate PP2A-B55 during G2-M transition. This pathway includes the kinase Greatwall (GW) and its substrates Arpp19 and Ensa. At mitotic entry GW is activated and promotes the phosphorylation of Arpp19/Ensa converting them into potent inhibitors of PP2A B55. Surprisingly, no other substrates of GW have been identified so far. However, several pieces of data strongly suggest new roles of GW independently of Arpp19 and Ensa. The main aim of this work was the identification of new substrates of GW. To this end, I used several approaches including: (1) Biochemical fractionation of cell lysates or Xenopus egg extracts combined with in vitro phosphorylation with recombinant GW kinase, (2) SILAC/phosphoproteomics from cell lysates expressing different GW amounts, (3) Co-Immunoprecipitation, (4) BioID and (5) a candidate directed approach. Results from in vitro phosphorylation revealed the presence of two interesting phosphorylated bands that are currently being analysed. Both SILAC/phosphoproteomic and interactome approaches yielded the enrichment of proteins involved post-transcriptional regulation of gene expression and RNA related processes, a physiological function already described for this pathway in yeast. Finally, we directly investigated the putative phosphorylation by GW of three candidates known to be involved in the control of cell cycle. Although phosphorylated in vitro by GW, we could only identify the phosphorylation site in one of these three proteins. This protein, corresponding to a phosphatase inhibitor, appears to control mitotic exit through the modulation of mitotic protein dephosphorylation. A non-phosporylable mutant of this inhibitor promotes a perturbed mitotic exit with delayed dephosphorylation of mitotic substrates and impaired cyclin B degradation. I could attribute this defect to a perturbed association of the inhibitor with the phosphatase and consequently to an aberrant timing of phosphatase inhibition. Finally, I identified the GW phosphorylation site as a key factor controlling this association. In summary, I identified in this study a new substrate of GW controlling phosphatase activity essential for correct mitotic division.