Études structurales de ligands peptidomimétiques de TRAIL complexés au récepteur de mort DR5

Structural studies of peptidomimetic ligands of TRAIL complexed to death receptor DR5

• Auteur / Autrice : Antoine Baudin
• Direction : Benoît Odaert
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie physique
• Date : Soutenance le 20/12/2018
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (Bordeaux ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Gilles Guichard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Gilles Guichard, Olivier Micheau, Olivier Lequin, Marie-France Giraud
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Olivier Micheau, Olivier Lequin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cristallographie

Chromatographie

Résonance magnétique nucléaire

Peptides

Ligands

Récepteurs cellulaires

Apoptose

Mots clés libres

Apoptose

RMN

Cristallographie

Protéines

Structure

Interactions

Apoptosis

NMR

Crystallography

Proteins

Structure

Interactions

Résumé

L'apoptose joue un rôle de protection contre la formation de cellules tumorales. Ce phénomène peut être régulé par la voie extrinsèque qui consiste en partie en l'activation du récepteur de mort DR5 (Death Receptor 5) par le ligand TRAIL (Tumor necrosis factor-Related Apoptosis Induction Ligand), dont l'intérêt majeur est d'induire l’apoptose des cellules tumorales uniquement. Nous nous sommes intéressés à des ligands peptidomimétiques de TRAIL : ces peptides de 16 acides aminés existent sous formes monomériques ou multimériques, et présentent des affinités pour la protéine DR5 jusqu’à 5 fois supérieures à celle de TRAIL. Des études fonctionnelles ont montré que ces ligands induisent l’apoptose des cellules tumorales in vitro, et ce de manière spécifique. Ils agissent également in vivo par réduction du volume de tumeurs de souris. Le but de ce projet est de caractériser les mécanismes d’interaction de ces peptides avec le récepteur DR5, par Résonance Magnétique Nucléaire et Cristallographie aux Rayons X. Nous avons produit le domaine extracellulaire de DR5 par voie recombinante en fusion avec la protéine NusA pour un meilleur repliement des protéines cibles, et un protocole de 4 étapes de purification a permis d’isoler la protéine DR5. Nous avons attribué 89 % des résonances du squelette peptidique de DR5 par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), et le calcul de structure secondaire a montré que la protéine adoptait en solution le même repliement secondaire en brins β que celui des structures de DR5 déposées dans la PDB (Protein Data Bank). Les titrations par RMN de DR5 avec les ligands monomériques et multimériques ont permis non seulement d’identifier la région d’interaction peptide-protéine dans le premier domaine riche en cystéines (CRD1) du récepteur, mais aussi de montrer que la liaison avec les oligomères entraînait des contacts protéine-protéine au niveau du CRD2, suggérant une dimérisation du récepteur. Cette hypothèse a été confirmée par des études de chromatographie d’exclusion de taille, qui ont montré une oligomérisation du récepteur en présence des dimères et trimères. Des études par cristallographie sont en cours afin de déterminer la structure atomique des complexes oligomériques avec DR5. Nos résultats montrent que ces ligands adoptent un mécanisme différent de celui de TRAIL dans l’activation de l’apoptose.

Apoptosis plays a protective role against the formation of tumor cells. This phenomenon can be regulated by the death receptor pathway, among which the Death Receptor 5 that can be activated by the TRAIL ligand (Tumor necrosis factor-Related Apoptosis Induction Ligand), whose major interest is to induce tumor cell apoptosis, specifically. Our work focuses on peptidomimetic ligands of TRAIL: those 16 amino acid peptides exist as monomers or multimers and show affinity for DR5 protein as up to 5-fold the affinity of TRAIL. Functional assays have shown that not only those ligands induce in vitro apoptosis of tumor cells, but also show selectivity for cancer cells, and can reduce mice tumor volume in vivo. The purpose of this project is to characterize the mechanisms by which those ligands interact with DR5, by using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and X-Ray Crystallography. We have produced the recombinant extracellular domain of DR5 in fusion with the NusA protein, in order to increase the folding of the protein, and we have purified the receptor through a 4-step protocol. We assigned the backbone resonances of 89 % of the protein residues with NMR, and secondary structure calculations showed that DR5 adopts the same β strand folding in solution as from the DR5 crystal structures from the PDB (Protein Data Bank). NMR titrations of DR5 with monomeric and multimeric ligands have allowed us to identify the peptide-protein binding area within the first Cystein Rich Domain (CRD1) of the receptor, but also that the binding with oligomeric peptides lead to protein-protein interactions at the level of the CRD2, suggesting the dimerization of the receptor. This was confirmed par Size Exclusion Chromatography assays that showed an oligomerization of the receptor in the presence of dimeric and trimeric peptides. Ongoing crystallography assays are conducted in order to determine the 3D structure at the atomic level of oligomeric complexes with DR5. Our results show that peptidomimetic ligands of TRAIL display a different mechanism from TRAIL in the activation of apoptosis.