Étude de la survie et de la viabilité de Listeria monocytogenes dans les effluents d’élevages porcins

Study of the survival and viability of Listeria monocytogenes in effluent from pig farms

• Auteur / Autrice : Jérémy Desneux
• Direction : Anne-Marie Pourcher
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 07/12/2015
• Etablissement(s) : Rennes 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la matière (Rennes ; 1996-2016)
• Partenaire(s) de recherche : PRES : Université européenne de Bretagne (2007-2016)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut national de recherche en sciences et technologies pour l'environnement et l'agriculture (France ; 2012-2019)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transcriptome

Porc

Listeria monocytogenes

Microbiologie

Mots clés libres

L. monocytogenes

Persistance

Effluents d’élevages porcins

Vbnc

Régulation transcriptionnelle

Résumé

La listériose est une maladie rare mais grave d’origine alimentaire provoquée par Listeria monocytogenes. En raison de sa capacité de survie importante dans les sols, la présence de cette bactérie dans les effluents d’élevages porcins destinés à être épandus constitue un problème de santé publique. L’un des facteurs pouvant expliquer la persistance de L. monocytogenes dans l’environnement est sa capacité à entrer dans un état viable mais non cultivable (VNC). Nos travaux avaient pour objectif, d’une part de suivre le comportement de L. monocytogenes dans les effluents d'élevages porcins (lisier et effluent de lagune) et notamment les formes VNC, et d’autre part d’étudier son adaptation lors de son transfert dans les effluents de lagune et dans le sol. Dans un premier temps, nous avons optimisé les conditions de la qPCR couplée au propidium monoazide (qPCR-PMA) afin d’adapter cette méthode au dénombrement des formes VNC de L. monocytogenes dans le lisier et l’effluent de lagune. Dans un second temps, nous avons comparé par méthode culturale, qPCR-PMA et qPCR, la survie de deux souches de L. monocytogenes RifR de sérogroupes IIb et IVb inoculées dans deux lisiers et dans deux effluents de lagune incubés à 8°C et 20°C. Malgré leur origine et leur sérotype différents, les deux souches ont présenté une survie similaire dans toutes les conditions testées. La survie des deux souches a été affectée par la température (une persistance plus élevée a été observée à 8°C) et par l’origine des effluents. Cette étude a mis en évidence que L. monocytogenes était capable d’entrer dans l’état VNC dans les lisiers et les effluents de lagune indépendamment de la température. Les formes VBNC qui représentaient 83 à 99,8% des bactéries viables après 60 jours d’incubation, sont apparues dès les premières heures de contact avec les effluents. Leur proportion, plus élevée en début d’expérience dans les lisiers que dans les effluents de lagune, était cependant du même ordre de grandeur dans les deux types de matrices après 60 jours. Afin de mieux comprendre l’adaptation de L. monocytogenes lors de son transfert dans l’effluent de lagune et dans le sol, nous avons comparé le transcriptome par la technologie RNA-seq de la souche CIP 110868, isolée d’un lisier, inoculée dans des extraits stériles d’effluent de lagune et de sol. L’analyse du transcriptome a été réalisée à T0 (génome de référence), après 20 minutes et 20 heures d’incubation. L’analyse par enrichissement fonctionnel a révélé des modifications transcriptomiques dès les 20 premières minutes d’incubation dans les deux matrices. Une augmentation du taux de transcrit de gènes impliqués dans le transport de protéines et de sucres a été observée. Le taux de transcrit des gènes contrôlés par le facteur sigmaB est augmenté indiquant la mise en place d’une réponse aux stress osmotiques et thermiques. De plus, l’adaptation de la souche CIP 110868 dans les extraits de sol et d’effluent de lagune s’est accompagnée d’une augmentation au cours du temps des taux de transcrit des gènes impliqués dans la virulence et des gènes sous le contrôle du régulateur prfA.

Listeriosis is a rare but serious illness caused by foodborne Listeria monocytogenes. Because of its important survival capacity in the soil, the presence of this bacteria in effluent from pig farms intended to be spread is a public health problem. One factor that may explain the persistence of L. monocytogenes in the environment is its ability to enter a viable but non-culturable state (VNC). Our studies were aimed, firstly to monitor the behavior of L. monocytogenes in effluent from pig farms (manure and lagoon effluent) including VNC forms, and also to study its adaptation at transfer to the lagoon effluent and soil. First, we have optimized the conditions of qPCR coupled with propidium monoazide (qPCR-LDCs) to adapt this method to count VNC forms of L. monocytogenes in the manure and lagoon effluent. Secondly, we compared by cultivation method, qPCR and qPCR-LDCs, the survival of two strains of L. monocytogenes RifR IIb and IVb serogroups manure inoculated in two and two lagoon effluent incubated at 8 ° C and 20 ° C. Despite their origin and different serotype, the two strains showed a similar survival in all conditions tested. The survival of both strains was affected by the temperature (higher persistence was observed at 8 ° C) and the origin of the effluent. This study showed that L. monocytogenes was able to enter the VNC state in manure and lagoon effluent regardless of temperature. VBNC forms which accounted for 83 99.8% of viable bacteria after 60 days of incubation, appeared in the early hours of contact with effluent. Their proportion, higher at the beginning of experience in the manure lagoon in the effluent, however, was of the same order of magnitude in the two types of matrices after 60 days. To better understand the adaptation of L. monocytogenes when transferred into the lagoon effluent and soil, we compared the transcriptome by RNA-Seq technology CIP 110868 strain, isolated from a slurry inoculated in sterile effluent lagoon and extracts of soil. Transcriptome analysis was performed at T0 (reference genome), after 20 minutes and 20 hours of incubation. Functional enrichment analysis revealed transcriptomic changes during the first 20 minutes of incubation in both matrices. An increase in the gene transcript levels involved in the transport of proteins and sugars was observed. The rate of transcribed genes controlled by the sigmaB factor is increased indicating the establishment of a response to osmotic and thermal stress. In addition, the adaptation of the CIP 110868 strain in soil extracts and lagoon effluent was accompanied by an increase in time of transcript levels of genes involved in virulence and gene under the control the prfA regulator.