Le biofilm de C. difficile : rôle des protéines de surface

The Clostridium difficile biofilm : role of the surface proteins

• Auteur / Autrice : Véronique Pantaleon
• Direction : Anne Collignon, Thomas Candela
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie et thérapeutiques anti-infectieuses
• Date : Soutenance le 11/03/2015
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Innovation Thérapeutique : du Fondamental à l'Appliqué (Châtenay-Malabry, Haut-de-Seine ; 2000-2015)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Ecosystème Microbien Digestif et Santé (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine)
• Jury : Président / Présidente : Marie-José Butel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thomas Candela, Marie-José Butel, Marie-Noëlle Bellon-Fontaine, Martine Pestel-Caron, Vincent Thomas
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Noëlle Bellon-Fontaine, Martine Pestel-Caron

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biofilms

Bactéries anaérobies

Bactéries aérobies

Clostridioides difficile

Mots clés libres

C. difficile

Biofilm

Protéase Cwp84

Couche S

SecA2

B. cereus

C. difficile

Biofilm

Cwp84 protease

S-layer

SecA2

B. cereus

Résumé

Clostridium difficile est responsable de vingt-cinq pour cent des diarrhées post-antibiotiques et de la majorité des cas de colite pseudomembraneuse. C'est un bacille anaérobie à Gram positif sporulant. La bactérie est recouverte par un réseau cristallin bidimensionnel appelé couche S. Elle est formée par deux sous-unités de haut et bas poids moléculaire issues du clivage du précurseur SlpA par la protéase Cwp84. Ces deux protéines sont codées par des gènes situés dans le locus cwp et sont sécrétées par le système de sécrétion de type SecA2. Elles sont impliquées dans l'adhésion/colonisation du côlon par C. difficile. L'adhésion est une étape commune avec la formation du biofilm par les bactéries. Le biofilm est une communauté bactérienne enchâssée et protégée par une matrice extracellulaire produite par les membres de la communauté. C'est le mode de vie principal des bactéries. Nous avons caractérisé la voie de sécrétion de type SecA2 de C. difficile. La protéine SecA2 (codée également par un gène du locus cwp) est essentielle pour la survie de C. difficile. Elle a une double localisation : le cytoplasme et la membrane intracellulaire. SecA2 de B. anthracis est capable de dimériser avec les protéines SecA1 et SecA2 de C. difficile. De plus, la complémentation du mutant secA2 de B. anthracis par le gène secA2 de C. difficile est fonctionnelle. Le rôle de la couche S, de la protéase Cwp84 et de la mobilité dans le biofilm de C. difficile ont été également étudiés. La souche 630∆erm forme un biofilm fin et fragile tandis que le mutant 630∆ermcwp84::erm forme un biofilm épais et robuste. Nous avons montré que l'activité protéolytique de Cwp84 était impliquée dans la formation du biofilm. De plus, une inhibition de la traduction de l'ARN slpA avec un ARN antisens spécifique permet une augmentation de la taille du biofilm formé par la souche 630∆erm. Similairement, l'expression de l’allèle secA2 muté dominant qui bloque au moins partiellement la voie de sécrétion de type SecA2 augmente la taille du biofilm. Nos résultats suggèrent que la couche S, la protéase Cwp84 et la protéine SecA2 sont impliquées dans la formation du biofilm de C. difficile. Par ailleurs nous avons testé un panel de souches dans leur capacité à former un biofilm. Les résultats montrent que les souches non mobiles ne seraient pas capables de former un biofilm épais. Enfin, nous avons étudié la capacité de C. difficile à se développer en aérobiose au sein d’un biofilm mixte avec Bacillus cereus. Nous avons mis en évidence un recrutement et une multiplication de C. difficile dans la pellicule formée à l'interface air/liquide par B. cereus. Un rapport optimal des spores des deux espèces est requis pour le développement de C. difficile dans ces conditions. La présence de spores de C. difficile dans la pellicule suggère que les biofilms de l'environnement pourraient être des réservoirs de spores de C. difficile, et à l'origine de contaminations humaine et animale.

Clostridium difficile is responsible for twenty-five percent of post-antibiotics diarrhea and for most cases of pseudomembranous colitis. It is an anaerobic, sporulating, Gram-positive bacillus. The bacterium is covered by a two-dimensional lattice called S-layer. It is formed by two subunits of high and low molecular weight after the cleavage of the SlpA precursor by the Cwp84 protease. These two proteins are encoded by genes located in the locus cwp and are secreted by the SecA2 secretion system. They are involved in colonic adhesion/colonization by C. difficile. Adhesion is a common step with biofilm formation by bacteria. The Biofilm is a microbial community embedded in and protected by an extracellular matrix produced by the community members. The biofilm is the main bacterial way of life.We have characterized the SecA2 secretory pathway of C. difficile. The SecA2 protein (as encoded by a gene locus cwp) is essential for the survival of C. difficile. It has a dual location: cytoplasm and intracellular membrane. SecA2 of B. anthracis is able to dimerize with SecA1 and SecA2 proteins of C. difficile. Moreover, the complementation of B. anthracis secA2 mutant with secA2 gene of C. difficile is functional.The role of the S-layer, of the Cwp84 protease and of the motility in the biofilm of C. difficile have also been studied. The 630∆erm strain forms a thin and weak biofilm while the 630∆ermcwp84::erm mutant forms a thick and robust biofilm. We have shown that proteolytic activity of Cwp84 was involved in biofilm formation. Furthermore, a decrease in the translation of slpA RNA with an antisense RNA specific permits an increase in the size of the biofilm of the strain 630∆erm strain. Similarly, the expression of the dominant mutated secA2 allele, which at least partially blocks the SecA2 secretory pathway, increases the biofilm size. Our results suggest that the S-layer, the Cwp84 protease and the SecA2 protein are involved in biofilm formation of C. difficile. On the other hand, we have tested a panel of strains in their capacity to form a biofilm. The results show that non-motile strains are unable to form a thick biofilm.Finally, we have studied the ability of C. difficile to grow aerobically in a mixed biofilm with B. cereus. We highlighted a recruitment and proliferation of C. difficile in the film formed at the air/liquid interface with B. cereus. An optimal ratio of spores of both species is required for the development of C. difficile in these conditions. The presence of C. difficile spores in the film suggests that the environment biofilms could be reservoirs of spores of C. difficile, and the source of human and animal contamination.