Biochemical, structural and functional characterization of PIP30, a novel regulator of proteasome activator PA28gamma

par Beata Jonik-Nowak

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Olivier Coux.

Le président du jury était Monsef Benkirane.

Le jury était composé de Olivier Coux, Monsef Benkirane, Paolo Cascio, Stéphane Manenti, Séverine Boulon, Michael, H. Glickman.

Les rapporteurs étaient Paolo Cascio, Stéphane Manenti.

  • Titre traduit

    Caractérisation biochimique, structurale et fonctionnelle de PIP30, un nouveau régulateur de l’activateur du protéasome PA28gamma


  • Résumé

    Le protéasome est responsable de la dégradation régulée d'une majeure partie des protéines intracellulaires. Cette machinerie multimoléculaire est composée d'un cœur catalytique, le protéasome 20S, qui peut être activé par plusieurs types de protéines régulatrices, en particulier la particule régulatrice 19S ou PA700, les complexes heptamériques formés par les membres de la famille 11S (ou PA28) et PA200. Au cours de ce travail, nous nous sommes focalisés sur PA28gamma, un régulateur nucléaire du protéasome, qui active la dégradation de plusieurs substrats par le protéasome 20S de façon indépendante de l'ubiquitine et de l'ATP. Malgré de multiples études montrant l'implication de PA28gamma dans de nombreux processus cellulaires essentiels tels que le cycle cellulaire, la prolifération, l'apoptose, l'architecture nucléaire, la dynamique de la chromatine, les infections virales et la réponse au stress, ses fonctions exactes ne sont pas encore comprises. De plus, les mécanismes impliqués dans la régulation de l'activité de PA28gamma et de son association avec le protéasome 20S restent mystérieux. Une analyse SILAC des partenaires d'interaction de PA28gamma endogène a révélé l'existence d'un nouveau facteur, non caractérisé, que nous avons appelé PIP30 (PA28gamma Interacting Protein 30 kDa). Le gène PIP30 contient un domaine très conservé chez les Eucaryotes. Nous avons produit et purifié la protéine PIP30 recombinante et montré qu'elle est faiblement structurée, malgré le fait qu'elle puisse se dimériser. Nous avons confirmé, aussi bien in vitro qu'in cellulo, que PIP30 interagit directement et spécifiquement avec PA28gamma. En analysant la co-immunoprécipitation de PA28gamma avec différents mutants tronqués de GFP-PIP30, nous avons pu identifier la séquence de PIP30 responsable de l'interaction avec PA28gamma dans sa partie C-terminale. Nous essayons maintenant d'identifier la séquence de PA28gamma impliquée dans la liaison de PIP30 et de cristalliser le complexe PA28gamma/PIP30. L'élaboration d'un anticorps anti-PIP30 « maison » nous a permis de montrer que PIP30 est une protéine nucléaire stable. Son niveau d'expression diminue en réponse à la déplétion de PA28gamma, ce qui suggère que PIP30 est stabilisée par son interaction avec PA28gamma in cellulo. Nous avons démontré in vitro que PIP30 inhibe partiellement l'activation médiée par PA28gamma des activités de type chymotrypsine et caspase, mais pas trypsine, du protéasome. Cependant, nous avons montré, par une approche ELISA, que PIP30 n'affecte pas la liaison de PA28gamma au protéasome 20S. Par ailleurs, nous avons testé l'effet de PIP30 sur la dégradation de p21 par le complexe PA28gamma/protéasome 20S et observé que PIP30 augmente la vitesse de dégradation de p21 dans ce test. Nos tentatives pour élucider la fonction exacte de PIP30 in cellulo n'ont jusqu'ici pas abouti à une conclusion convaincante. L'ensemble de ces résultats suggère que PIP30 pourrait être impliqué dans le recrutement sélectif des substrats de PA28gamma et/ou dans la modulation de l'activation du protéasome par PA28gamma.


  • Résumé

    The proteasome is responsible for the regulated degradation of most intracellular proteins. This multi-subunit machinery is composed of a common catalytic core, the 20S proteasome, which can be activated by various types of regulators, notably the 19S regulatory particle or PA700, the heptameric complexes formed by the members of the 11S (or PA28) family and PA200. This work has been focused on PA28gamma, a nuclear regulator of the proteasome, which has been shown to activate degradation of several proteasomal substrates in an ATP- and ubiquitin- independent manner. Despite many evidences revealing the involvement of PA28gamma in many essential cellular processes, such as cell cycle progression, proliferation, apoptosis, nuclear architecture, chromatin dynamics, viral infection and stress response, its exact function(s) remain to be understood. In addition, how PA28gamma activity and association to the 20S proteasome are regulated is completely unclear. A SILAC-based analysis of endogenous PA28gamma interaction partners revealed the existence of a novel, completely uncharacterized protein, which we called PIP30 (PA28gamma Interacting Protein 30 kDa). Evolutionary analysis indicates that PIP30 gene contains a domain highly conserved in Eukaryotes, without any alternative splicing or gene duplication evidences. We produced and purified the recombinant PIP30 protein and showed that it is poorly structured, although it is able to make dimers. We confirmed both in vitro and in cellulo that PIP30 directly and specifically interacts with PA28gamma. By analyzing the co-immunoprecipitation of PA28gamma with various GFP-PIP30 truncation mutants, we identified the sequence of PIP30 responsible for PA28gamma binding in its C-terminal part. Ongoing analyses now focus on the identification of PIP30 binding motif on PA28gamma sequence and the crystallization of the PA28gamma-PIP30 complex. Using homemade anti-PIP30 antibodies, we showed that PIP30 is a stable nuclear protein. Its expression level is decreased in response to PA28gamma depletion, suggesting that it is stabilized by its interaction with PA28gamma in cellulo. We demonstrated in vitro that PIP30 partially inhibits PA28gamma-mediated activation of the chymotrypsin- and caspase-, but not the trypsin-like, activities of the proteasome. However, we showed by an ELISA-based approach that PIP30 does not affect PA28gamma binding to 20S. Considering the limitations of probing proteasome activity with small fluorogenic substrates, we tested the effect of PIP30 on the PA28gamma-dependent proteasomal degradation of in vitro translated p21, a known protein substrate of PA28gamma. We unexpectedly found that PIP30 enhanced the rate of p21 degradation. Our attempts to elucidate the exact functions of PIP30 in cellulo were unsuccessful so far. Altogether, our results suggest that PIP30 could be involved in the selective recruitment of PA28gamma protein substrates and/or modulate PA28gamma-mediated proteasome activation.

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