Structural studies of human general transcription factor TFIID core-complexes

par Matthias Haffke

Thèse de doctorat en Biologie structurale et nanobiologie

Sous la direction de Imre Berger.

Soutenue le 12-11-2014

à Grenoble , dans le cadre de École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble) , en partenariat avec European Molecular Biology Laboratory. Grenoble (laboratoire) .

Le président du jury était Winfried Weissenhorn.

Le jury était composé de Joanna Timmins.

Les rapporteurs étaient Thomas Schalch, Laszlo Tora.

  • Titre traduit

    Etudes structurales du facteur de transcription général humain TFIID CORE-COMPLEXES


  • Résumé

    La transcription des gènes humains par la polymérase II (Pol II) commence avec l'assemblage du complexe de pré-initiation (PIC) au niveau du promoteur. L'assemblage du PIC est initié par le facteur de transcription général TFIID, un complexe de protéines faisant 1 mégadalton et contenant TBP et 13 facteurs TBP-associés (TAF). Des études structurales sur TFIID par cryo-EM ont révélé l'architecture globale de TFIID, donnant un aperçu de l'assemblage des sous-unités et la reconnaissance du promoteur à faible et moyenne résolution. Cependant, les structures à haute résolution de plusieurs TAF ne sont pas disponibles à ce jour, ce qui limite notre compréhension actuelle des interactions TAF-TAF et du mécanisme d'assemblage de TFIID.J'ai utilisé une stratégie de co-expression dans des cellules d'insectes sur la base de notre système MultiBac afin d'obtenir des sous-complexes recombinants TFIID de qualité sans précédent et de quantité suffisante pour des études structurales. J'ai cristallisé un complexe contenant les TAFs TAF5, TAF6 et TAF9 et déterminé sa structure à une résolution de 2.7 Å. Notre structure donne des aperçus détaillés sur les interactions de ces sous-unités essentiels de TFIID: La structure révèle des interactions serrés inattendues entre le domaine N-terminal et le domaine à répétition WD40 contenant 7 lames de TAF5 avec le domaines "histone fold" (HFDs) de TAF6/9. Les interactions entre ces domaines conservés inter-espèces expliquent en détail comment TAF5 sert de plate-forme de liaison pour les HFDs dans TFIID. Cette étude étend notre compréhension de l'échafaudage moléculaire au noyau central de la version humaine de TFIID, ce qui est essentiel pour la formation de holo-TFIID.De plus, j'ai pu isoler un domaine structural conservé de la version humaine de TAF6, le domaine à répétition HEAT de TAF6 en utilisant une approche de protéolyse limitée sur des core-complexes TAF5/6/9 prédéfinis. J'ai pu déterminer la structure du domaine à répétition HEAT de TAF6 jusqu'à 2,0 Å de résolution. La structure offre un éclairage supplémentaire sur l'architecture de la version humaine de TFIID et révèle la présence d'une grande zone chargée positivement sur sa surface, probablement impliqué dans la liaison à l'ADN du noyau promoteur liaison.Basé sur les structures résolues et les informations obtenues dans des expériences de protéolyse limitée, j'ai pu identifier les complexes minimaux de la base du complexe TFIID humain (TAF 4/5/6/9/12). J'ai identifié les HFDs de l'hétérodimère TAF4/12 comme étant essentielle à la formation d'un complexe avec TAF5/6/9. Ces résultats guideront la conception future de construction pour la cristallisation du complexe humain TFIID de base, améliorant ainsi nos connaissances sur le mécanisme d'assemblage de TFIID ainsi que sur l'architecture de ses principaux composants à une résolution atomique.


  • Résumé

    Human gene transcription by Polymerase II (PolII) begins with the assembly of the pre-initiation complex (PIC) at the promoter. PIC assembly is initiated by the general transcription factor TFIID, a megadalton sized protein complex containing TBP and 13 TBP associated Factors (TAFs).
Structural studies on TFIID by cryo-EM have revealed the overall architecture of TFIID, providing insights into subunit assembly and promoter recognition at low to medium resolution. However, high-resolution structures of several TAFs are not available to date, limiting our current understanding of TAF-TAF interactions and the assembly mechanism of TFIID.I used a co-expression strategy in insect cells based on our MultiBac system to obtain recombinant TFIID sub-complexes of unprecedented quality and quantity for structural studies. I crystallized a complex containing the TAFs TAF5, TAF6 and TAF9 and determined its structure up to a resolution of 2.7 Å. Our structure gives detailed insights into the interactions of these essential TFIID subunits: The structure reveals unexpected tight interactions between the N-terminal domain and the 7-bladed WD40 repeat domain of TAF5 with the TAF6/9 histone fold domains (HFDs). The interactions between these inter-species conserved domains explain in detail how TAF5 serves as a binding platform for HFDs in TFIID. This study extends our understanding of the molecular scaffold at the central core of human TFIID, which is essential for holo-TFIID formation.Additionally, I could isolate a conserved structural domain of human TAF6, the TAF6 HEAT repeat domain by using a limited proteolysis approach on predefined TAF5/6/9 core-complexes. I could determine the structure of the TAF6 HEAT repeat domain up to 2.0 Å resolution. The structure provides additional insights into the architecture of human TFIID and reveals the presence of a large positively charged patch on its surface, probably involved in core-promoter DNA binding.Based on the obtained structures and information gained in limited proteolysis experiments, I was able to identify minimal complexes of human core-TFIID (TAFs 4/5/6/9/12). I identified the HFDs of the TAF4/12 heterodimer to be essential for the complex formation with TAF5/6/9. These findings will guide future construct design for crystallization of human core-TFIID, enhancing our knowledge about the TFIID assembly mechanism and the architecture of its core-components at atomic resolution.

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