Evolution dirigée d'enzymes in vivo et in vitro par microfluidique de gouttelettes

In vivo and in vitro directed evolution of enzymes using droplet-based microfluidics

• Auteur / Autrice : Alexei Godina
• Direction : Andrew D. Griffiths
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 01/02/2013
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques (Strasbourg ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de science et d’ingénierie supramoléculaires (Strasbourg)
• Jury : Président / Présidente : Nicolas Winssinger
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Patrick Tabeling, Uwe Theo Bornscheuer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Criblage pharmacologique

Microfluidique

Enzymes

Mots clés libres

Ingéniérie des protéines

Evolution dirigée

Microfluidique en gouttelettes

Criblage à haut débit

Rétro-aldolase

Détergent protéases

Enzymes

Expression in vitro

Protein engineering

Directed evolution

Droplet-based microfluidics

High-throughput screening

Retro-aldolase

Detergent proteases

Enzymes

In vitro expression

Résumé

L’ingénierie des protéines fonctionnelles est un processus d’amélioration des propriétés physiques ou catalytiques d’enzyme au travers d’approches rationnelles et d'évolution dirigée, aussi bien que la combinaison des deux méthodes. Malgré le progrès de la modélisation moléculaire des protéines, les méthodes de prédiction restent aléatoires et un grand nombre de variantes restent à tester. De ce fait, le développement et l’utilisation d’un système de criblage d’activité de protéines à très haut débit, comme la microfluidique en gouttes, est indispensable. Cette thèse de doctorat présente trois projets d’évolution dirigée de protéines en trois approches différentes avec expression d’enzyme in vitro et in vivo. Les plateformes microfluidiques ont été développées et validées pour chaque projet. De plus, plusieurs banques de variants ont été criblées avec, dans certains cas, isolement de molécules 5-10 fois que le clone parental.

This work describes the development of high-throughput droplet microfluidic platforms fine-tuned for protein of interest and their employment in directed evolution experiments. When not available, fluorogenic assay for monitoring desired enzyme activity (-ies) in droplets was developed. Moreover, the in vivo expression allowed the successive integration of microfluidic modules on the same chip. After a couple of evolution rounds the initial retro-aldolase variant was significantly improved. In other project, to meet industrial requirements a high-throughput screening platform for protease evolution in detergent has been assembled and validated. Two evolution rounds showed the accumulation of a certain pool of beneficial mutations over the selection rounds. The research described in this work highlighted that in vitro expression systems are sensitive to the amount of supplied DNA and reaction conditions. This observation led to the development of a multistep completely in vitro microfluidic platform.