Approches innovantes appliquées à l’identification des auto-antigènes dans les hépatites auto et allo-immunes

Innovative approaches applied to identify autoantigens in auto and alloimmune hepatitis.

• Auteur / Autrice : Elvire Beleoken Ongmessen
• Direction : Jean-Charles Duclos-Vallée, Éric Ballot
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 10/09/2013
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Cancérologie : Biologie, Médecine, Santé (2000-2015 ; Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Pathogénèse et traitement de l'hépatite fulminante et du cancer du foie (Villejuif, Val-de-Marne ; 2006-2015)
• Jury : Président / Présidente : Malcolm Buckle
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Charles Duclos-Vallée, Éric Ballot, Malcolm Buckle, Charles Pineau, Sylvaine You, Pierre Aucouturier, François Le Naour
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Charles Pineau, Sylvaine You

Mots clés

Mots clés contrôlés

Marqueurs biologiques

Protéomique

Hépatite

Mots clés libres

Auto-antigène

Hépatite auto-immune

Hépatite allo-immune

Analyse sérologique du protéome

Spectrométrie de masse

Résonance plasmonique de surface par imagerie

Biomarqueur

Autoantigen

Autoimmune hepatitis

Alloimmune hepatitis

Serological proteome analysis

Mass spectrometry

Surface plasmon resonance imagery

Biomarker

Résumé

L’hépatite allo-immune post-greffe de moelle osseuse (GMO) est très mal définie. Le premier objectif de notre thèse était d’identifier, par analyse sérologique du protéome, les antigènes (Ag) cibles d’auto-anticorps (Ac) présents dans le sérum de patients. Cinq patients, ayant reçu une GMO, ont développé des troubles hépatiques à l’arrêt du traitement immunosuppresseur, avec des signes histologiques ressemblant à ceux des hépatites auto-immunes (HAI). Avant et pendant l’épisode hépatique, des serums ont été testés sur des immunoblots réalisés avec des protéines nucléaires, cytosoliques, microsomiques et mitochondriales obtenues à partir d’homogénat de foie de rat, séparées par électrophorès bi-dimensionnelle et transférées sur membrane de nitro-cellulose. Après digestion trypsique, les protéines d’intérêt, marquées uniquement ou plus intensément par les sérums en phase d’hépatite, étaient identifiées par spectrométrie de masse MALDI-TOF/TOF et nanoHPLC LTQ-Orbitrap®. Un nombre total de 103 protéines antigéniques a été identifié, parmi lesquelles 12 sont reconnues par les sérums de 3 patients. A l’issue de cette première description immunologique des hépatites allo-imunes post-GMO, nous formulons des hypothèses physiopathologiques permettant d’expliquer l’évolution d’un mécanisme allo-immun vers une réaction auto-immune. En outre, nous recommandons la réduction très progressive des doses d’immunosuppresseur après GMO.La protéine hnRNP A2/B1 est une cible des anticorps anti-nucléaires (AAN) dans le lupus érythémateux disséminé (LED), la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’HAI. Dans la deuxième partie de la thèse, le but était de caractériser les interactions Ag-Ac en fonction de la pathologie, en utilisant la résonance plasmonique de surface par imagerie (SPRi). Trente-neuf peptides chevauchants de 17 acides aminés, couvrant l’ensemble de l’isoforme B1 de la protéine humaine, ont été immobilisés à la surface d’un prisme. Les interactions entre les peptides immobilisés et les sérums de 8 patients de chaque pathologie et de donneurs sains (D) ont été étudiées en temps réel. Les constantes de vitesse de dissociation koff, calculées pendant la phase de dissociation des complexes Ag-Ac formés, reflètent la stabilité de ces complexes.Plusieurs interactions significatives ont été observées : i) avec une stabilité élevée entre P55-70 et les sérums d’HAI par rapport aux contrôles (p= 0.003); ii) avec une faible stabilité entre P118-133 et P262-277 et les serums de LED, P145-160 et les sérums de PR par rapport aux serums D (p=0, 006; p=0,002; p=0,007). Le peptide P55-70 est donc un biomarqueur potentiel dans l’HAI. Les courbes d’interaction et les koff observés après la formation de complexes avec des anticorps anti-IgG et anti-IgM d’une part, et le traitement des sérums par des nucléases d’autre part, montrent que : i) les IgM sont majoritaires et ii) des acides nucléiques, présents ou non selon la maladie auto-immune, participent aux interactions entre les anti-hnRNP B1 et le peptide AA55-70 ainsi qu’entre les autres peptides et les sérums témoins, et contribuent à la stabilité des complexes Ag-Ac. Les résultats de nos travaux et les innovations technologiques en spectrométrie de masse et en SPR permettent d’envisager la mise au point de nouveaux tests pour le suivi des patients atteints d’hépatites auto et allo-immunes.

Alloimmune hepatitis following bone marrow transplantation (BMT) is poorly characterized. The first goal of this thesis was to identify antigens (Ag) targets of autoantibodies (auto-Ab) in sera from patients, using serological proteome analysis. Five patients who received an allogeneic BMT developed liver dysfunctions with histological features suggestive of autoimmune hepatitis (AIH) after the withdrawal of immunosuppressive therapy. Before and during the onset of hepatic dysfunction, sera were tested on immunoblots performed with cytosolic, microsomal, mitochondrial and nuclear proteins from rat liver homogenate, resolved by two-dimensional electrophoresis and transferred onto nitrocellulose membranes. After tryptic digestion, antigenic targets were identified by two tandem mass spectrometry techniques: MALDI-TOF/TOF and nanoHPLC LTQ Orbitrap®. A total of 103 different proteins were identified. Twelve of them were recognized by sera from three patients. This is the first immunological description of hepatitis occurring after BMT, enabling a discussion of the mechanisms that transform an alloimmune reaction into an autoimmune response. Any decision to withdraw immunosuppression after allogeneic BMT should be made with caution and hepatic parameters monitored systematically.Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A2/B1 is a target for antinuclear autoantibodies in systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), and autoimmune hepatitis (AIH). In the second part of the thesis, the goal was to characterize Ag-Ab interactions as a function of pathology, using surface plasmon resonance imagery (SPRi). Sera from 8 patients from each pathology and healthy donors (D) were passed across a SPRi surface containing 39 overlapping peptides of 17 mers covering the human hnRNP B1. Interactions involving the immobilised peptides were followed in real time and dissociation rate constants koff for each interaction were calculated. koff values reflect the stability of the complex. Several significant interactions were observed: i) high stability (lower koff values) between P55-70 and the AIH sera compared to controls (p= 0.003); ii) lower stability (higher koff values) between P118-133 and P262-277 and SLE sera, P145-160 and RA sera compared to controls (p=0.006, p=0.002, p=0.007). These results indicate that P55-70 of hnRNP B1 is a potential biomarker for AIH in immunological tests.The binding curves and koff values observed after the formation of complexes with anti-IgM and anti-IgG antibodies and after nuclease treatment of the serum indicate that i) IgM isotypes are prevalent and ii) circulating nucleic acids, present or absent according to the autoimmune disorders, participate in the interaction between anti-hnRNP B1 and P55-70 and also between controls and the peptides studied and are involved in antigen-antibody stability. Results from our work as well as promising innovations in mass spectrometry and SPR technologies lead us to consider the development of new tests, usable in monitoring patients with auto and alloimmune liver diseases.