Physiologie du compartiment endothélial circulant dans l’hypertension artérielle pulmonaire et perspectives de développement d’un produit de thérapie cellulaire

Physiology of circulating endothelial compartment in pulmonary arterial hypertension and perspectives of developmant of a cell therapy product

• Auteur / Autrice : Laetitia Mauge
• Direction : David Smadja, Pascale Gaussem
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 25/10/2012
• Etablissement(s) : Paris 5
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, environnement (Paris ; 2010-2013)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Service d'hématologie A
• Jury : Président / Présidente : Pierre-Louis Tharaux
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : David Smadja, Pascale Gaussem, Pierre-Louis Tharaux, Florence Sabatier-Malaterre, Philippe Nguyen, David Montani
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Florence Sabatier-Malaterre, Philippe Nguyen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Thérapeutique cellulaire

Hypertension artérielle pulmonaire

Cellules endothéliales

Mots clés libres

Cellules endothéliales circulantes

Progéniteurs endothéliaux circulants

Hypertension artérielle pulmonaire

Mobilisation

Thérapie cellulaire

Circulating endothelial cells

Circulating endothelial progenitor cells

Pulmonary arterial hypertension

Mobilization

Cell therapy

Résumé

L’endothélium joue un rôle primordial dans le développement et le maintien des multiples fonctions vasculaires. Il est ainsi largement impliqué dans des situations pathologiques comme les maladies cardio-vasculaires. La description de marqueurs endothéliaux circulants a permis une exploration non invasive de l'endothélium. Notre équipe s’est intéressée principalement aux cellules endothéliales circulantes (CEC), dont le taux reflète la lésion ou l’activation de l’endothélium, et aux progéniteurs endothéliaux circulants (PEC), marqueurs de régénération endothéliale. La découverte en 1997 par Asahara de la présence chez l’adulte de ces PEC, participant à la formation de nouveaux vaisseaux par vasculogenèse, a ouvert de nouvelles perspectives, notamment pour la thérapie cellulaire des pathologies ischémiques. Ce travail a consisté à développer les méthodes d’étude de ces cellules dans plusieurs contextes. Tout d’abord, nous avons exploré l’utilité de ces marqueurs dans la physiopathologie de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Puis nous avons analysé le potentiel de mobilisation des progéniteurs endothéliaux à partir de la paroi vasculaire lors d’une ischémie locale chez des volontaires sains dans le cadre du développement d’un produit de thérapie cellulaire autologue. Une partie de ce projet a été de mettre en place et d’optimiser les techniques d’étude de ces marqueurs. Les CEC ont été quantifiées par immunoséparation magnétique (IMS), technique mise au point en 1992 (Dignat-George 1992) et transférée dans notre laboratoire. La quantification des PEC a été réalisée par cytométrie en flux et par culture cellulaire. En culture, deux types de PEC sont décrits : les PEC précoces, dont l’origine est monocytaire et pour lesquels la culture est déjà standardisée, et les « Endothelial Colony Forming Cells » (ECFC), seules cellules présentant des caractéristiques de cellules endothéliales progénitrices et pouvant être proposées comme produit de thérapie cellulaire. Nous avons optimisé la quantification des ECFC en culture en étudiant l’effet de diverses matrices et de la densité d’ensemencement des cellules mononucléées issues du sang total sur l’obtention de ces cellules et leurs propriétés angiogènes. La dysfonction endothéliale a été décrite comme un élément central dans le développement de l’HTAP dont le diagnostic repose sur la mesure de la pression artérielle pulmonaire par cathétérisme cardiaque droit. En l’absence de marqueur biologique non invasif dans cette maladie, nous avons quantifié les CEC et les progéniteurs circulants dans deux études. Une étude réalisée chez des patients adultes a montré une augmentation spécifique des CEC dans l’HTAP et non dans l’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique. Ainsi les CEC semblent être le reflet des lésions endothéliales pulmonaires et non de la sévérité clinique des patients. L’autre étude a montré l’intérêt de la quantification des CEC dans la prise en charge thérapeutique des enfants souffrant d’HTAP secondaire à une cardiopathie congénitale, dont les formes irréversibles présentaient des taux élevés de CEC. Nous avons ainsi défini un nouveau marqueur non invasif à utilité diagnostique et pronostique. Les PEC sont des cellules rares dans le sang circulant, difficiles à expandre, et dont les essais de mobilisation médullaire se sont révélés insuffisants. L’hypothèse récente d’une réserve vasculaire des progéniteurs endothéliaux nous a conduits à étudier l’effet d’un processus d’ischémie locale sur la mobilisation de ces cellules chez des volontaires sains. Deux groupes d'âge ont été inclus afin d'évaluer l'impact du vieillissement sur la méthode de mobilisation étudiée. Malgré un effet de cette ischémie sur la dilatation endothéliale cette méthode n’a pas permis de mobiliser significativement les PEC issus de la paroi endothéliale, quel que soit l'âge des sujets. A l’inverse, l’hypoxie a eu un effet délétère sur les capacités angiogènes des ECFC.

The endothelium plays a key role in the development and the homeostasis of vascular functions. It is also well involved in pathological situations like cardiovascular diseases. Thanks to the description of circulating endothelial markers, non invasive study of the endothelium is now possible. Our group was particularly interested in circulating endothelial cells (CECs), the level of which reflects an endothelial activation or lesion, and to circulating endothelial progenitors cells (EPCs), markers of endothelial repair. EPC description by Asahara in 1997 in adult blood, involved in new blood vessel formation by vasculogenesis, offered new perspectives, specially for cell therapy in ischemic diseases. This work consisted in the development of methods to study these markers in different contexts. First, we explored the interest of these markers in the physiopathology of pulmonary arterial hypertension (PAH). Then we evaluated endothelial progenitors mobilization from the vascular wall by a local ischemia process in healthy volunteers, in the perspective of an autologous cell therapy product development. One part of this project was the implementation and optimization of the methods to study CEC and EPC. CEC were quantified by magnetic immunoseparation. This technique was developped in 1992 by F. Dignat-George's group and transferred in our laboratory. EPC were quantified by flow cytometry and cell culture. Two types of EPC are described in culture: the early EPC, which originate from monocyte lineage and which culture is standardized, and the « Endothelial Colony Forming Cells » (ECFC), the only cells presenting endothelial progenitor cell properties and which use as a cell therapy product can be considered. ECFC quantification by culture was optimized by assessment of the impact of diverse matrices and seeding concentrations of mononuclear cells isolated from whole blood, on ECFC commitment and their angiogenic properties. Endothelial dysfunction was described as a central element in the development of PAH, which diagnosis is based on the use of right heart catheterization. Due to the lack of noninvasive marker for this disease, CEC and circulating progenitors were quantified in two studies. One of them realized in adult patients showed a specific increase of CEC in PAH and not in post-embolic PH. CEC would then reflect the presence of specific endothelial lesions and not the clinical state of the patients. The other study demonstrated the interest of CEC quantification in the therapeutic care of children with PAH secondary to congenital heart disease, for whom patients in irreversible state had a higher level of CEC. We then defined a new noninvasive biomarker.that can be used for the diagnosis and prognosis of PAH. EPC are rare events in whole blood, difficult to expand and for which, mobilization protocols revealed insufficient. The recent hypothesis of a vascular reservoir for endothelial progenitor led us to study the effect of a local ischemia procedure on the mobilization of these cells in healthy volunteers. Two age groups were included to assess the impact of aging on this procedure. Despite a significant endothelial dilation with the local ischemia, no EPC were mobilized, whatever the age group. Ischemia even altered ECFC angiogenic properties.