Vectorisation de siRNA dirigés contre l'oncogène de fusion RET/PTC1 impliqué dans le carcinome papillaire de la thyroïde par des nanoparticules de squalène

Vectorization of siRNA targeting RET/PTC1 jonction oncogene by squalene nanoparticles

• Auteur / Autrice : Mouna Raouane
• Direction : Liliane Massade, Patrick Couvreur
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Oncologie, Pharmacologie et thérapeutiques
• Date : Soutenance le 10/11/2011
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Cancérologie : Biologie, Médecine, Santé (2000-2015 ; Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Galien Paris-Saclay (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 1998-....) - Vectorologie et thérapeutiques anti-cancéreuses (Villejuif, Val-de-Marne ; 2010-2019)
• Jury : Président / Présidente : Christian Auclair
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Liliane Massade, Patrick Couvreur, Christian Auclair, Denis Wouessidjewe, Guy Chabot, Didier Desmaële
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Denis Wouessidjewe, Guy Chabot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Nanoparticules

Petit ARN d'interférence

Squalène

Oligonucléotides

Cancérogenèse

Nanomédecine

Mots clés libres

Squalène

Nanoparticules

SiRNA

RET/PTC1

Oncogène de fusion

Carcinome papillaire de la thyroïde

Gala-cholestérol

Délivrance in vivo

Squalène

Nanoparticules

SiRNA

RET/PTC1

Fusion oncogene

Papillary Thyroid Carcinoma

GALA-cholesterol

Gene delivery

Résumé

Le cancer papillaire de la thyroïde (PTC) représente 70-80% des cas de cancers de la thyroïde. Il est principalement caractérisé par des réarrangements chromosomiques affectant le gène RET. Le réarrangement RET/PTC1, dans lequel RET est réarrangé avec un gène proapoptotique H4, représente 30% des cas sporadiques et jusqu’à 60% des cas survenus après irradiation. Afin d’inhiber l’oncogène de fusion RET/PTC1, nous avons utilisé un siRNA ciblant la zone de jonction RET/PTC1 (siRNA RET/PTC1) au niveau de l’ARN messager des cellules tumorales et montré sa spécificité et son efficacité. Néanmoins, le développement des siRNAs comme molécule d’intérêt thérapeutique se heurte in vivo à des difficultés liées à leur administration. Sous forme libre, ces molécules sont, en effet, très vite dégradées par les nucléases extracellulaires et leur pénétration intracellulaire est limitée. C’est la raison pour laquelle il est nécessaire de les vectoriser. Nous avons choisi de le faire par la méthode de « squalénisation » et avons couplé d’une manière covalente le squalène, un lipide naturel précurseur de la biosynthèse du cholestérol, au siRNA RET/PTC1. Le bioconjugué formé s’autoassemble spontanément en milieu aqueux sous forme de nanoparticules stables de 170 nm de diamètre. L’efficacité et la toxicité des nanoparticules siRNA RET/PTC1-squalène ont été étudiées in vitro dans deux lignées de PTC exprimant RET/PTC1 (BHP10-3 et TPC-1) et l’activité antitumorale a été évaluée in vivo sur des souris athymiques xénogreffées par BHP10-3 puis traitées en i.v. par ces nanoparticules. Les nanoparticules siRNA RET/PTC1-squalène ont montré une bonne efficacité antitumorale. En revanche, aucune activité inhibitrice n’a été retrouvée in vitro. En conclusion, nous avons réussi à vectoriser le siRNA RET/PTC1 par la méthode de squalénisation. Cette étude ouvre des perspectives thérapeutiques pour certains patients atteints de PTC et réfractaires au traitement conventionnel.

The papillary thyroid carcinoma (PTC) is the most common type of thyroid malignancy. This tumour is associated with somatic mutations of the RET proto-oncogene, due to gene rearrangements of the proto-RET. RET/PTC1 rearrangement is the most common genetic alteration identified to date, it is formed by an intra chromosomic rearrangement which leads to the juxtaposition of the RET Tyrosine Kinase domain of the proto-RET with the gene H4. The fusion RET/PTC1 oncogene represents an interesting target for small interfering RNA (siRNA) strategies since it is present only in the tumour cells and not in the surrounding normal cells. However, the biological efficacy of the siRNAs is hampered by their short plasma half-life due to poor stability in biological fluids and low intracellular penetration. In order to protect siRNA from degradation, and to improve their intracellular capture, we applied the concept of “squalenoylation”, ie. The bioconjugation of a drug substance to squalene, for the delivery of siRNA targeted toward the RET/PTC1 fusion oncogene. The acyclic isoprenoid chain of squalene was covalently coupled with RET/PTC1 siRNA at the 3’-terminus of the sense strand via a stable thioether linkage. The linkage of RET/PTC1 siRNA to squalene leads to an amphiphilic molecule that self-organise in water as RET/PTC1 siRNA-SQ nanoassemblies of 170 nm and Zeta potential of -26.4 mV. These RET/PTC1 siRNA-SQ NPs did not showed any cytotoxicity in vitro. Interestingly, in vivo, in a mouse xenografted RET/PTC1 experimental model, RET/PTC1 siRNA-SQ nanoparticles inhibited tumour growth, RET/PTC1 oncogene and oncoprotein expression, after intravenous injections of 2.5 mg/kg cumulative dose. In the last of this work, GALA-cholesterol combination with siRNA-SQ NPs further enhanced nucleic acid internalization, promoted their escape into the cytosol and consequently their gene silencing efficiency in vitro. In conclusion, these results showed that the “squalenoylation” offers a new non cationic plate-form for the siRNA delivery.