Dosages immunoenzymatiques plasmatiques et intracellulaires des antirétroviraux anti-VIH : développement et applications

Design and synthesis of new immunogenes for the development of plasma and intracellular enzymatic immunoassay of antiretroviral drugs used in HIV therapy

• Auteur / Autrice : Stéphane Azoulay
• Direction : Danièle Duval
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Nice
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences fondamentales et appliquées (Nice2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de chimie bio-organique (Nice)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Analyse enzymatique

Immunodosage

Antirétroviraux

VIH (virus)

Résumé

Le développement de méthodes de mesures, adaptées au suivi thérapeutique, des molécules utilisées en thérapie anti-VIH doit permettre d'optimiser l'administration des anti-rétroviraux, d'assurer une meilleure efficacité des traitements et de limiter les effets secondaires. Nous avons développé des dosages immunoenzymatiques (EIA) de l'efavirenz, de la névirapine et du lopinavir. Nous avons synthétisé les immunogènes nécessaires à l'obtention d'anticorps spécifiques par introduction sur ces molécules d'un chaînon possédant une fonction acide carboxylique puis couplage avec la KLH et l'AChE pour obtenir les immunogènes et les traceurs correspondants. Les anticorps anti-EFZ bien que d'une grande sensibilité reconnaissent des métabolites présents dans le plasma des patients et le dosage n'a pas été finalisé. Les anticorps anti-NVP et anti-LPV ont permis la mise au point d'un EIA d'une grande sensibilité (limite de détection < 500 pg/mL). Ces dosages ont été appliqués à la détermination des taux plasmatiques et intracellulaires. Les résultats montrent : qu'il n'y a pas d'accumulation de la NVP ou du LPV à l'intérieur de la cellule, une grande variabilité interpatient et une absence de corrélation entre les concentrations extra- et intracellulaires qui soulignent toute l'importance du dosage intracellulaire pour le suivi thérapeutique. Par ailleurs, à l'aide de ces dosages nous avons montré que les inhibiteurs de protéase s'accumulent de façon dose dépendante dans les cellules adipeuses de différents modèles murins et dans un modèle adipocytaire humain (hMADS). La synthèse de sondes de fluorescence nous a permis de localiser ces drogues notamment dans les gouttelettes lipidiques.

Development of quantification methods, adapted to the therapeutic drug monitoring (TDM), for molecules used in anti-HIV therapy has to allow to optimize the administration of the drugs, to insure a better efficiency of treatments and to limit side effects. We developed some enzymz immunoassay (EIA) of efavirenz, nevirapine and lopinavir. We synthesised immunogene necessary for the obtaining of specific antibodies by introduction on these molecules of a link possessing a carboxylic acid function then coupling with KLH and AChE to obtain immunogene and corresponding tracers. Anti-EFZ antibodies despite a high sensibility recognize metabolites present in plasma of the patients and the assay was not finalized. Anti-NVP antibodies and anti-LPV allowed the development of an high sensitive EIA (limit of detection < 500 pg / mL). These assay were applied to the determination of plasma and intracellular levels. The results show: that there is no accumulation of NVP or LPV inside the cell, a huge interpatient variability and an absence of correlation between extra-and intracellular concentrations which emphasize all the importance of the intracellular quantification for the TDM. Furthermore, by application of these assay, we showed that protease inhibitors accumulate in a dose dependant manner in adipose cells of various murin models and in a new human adipocyte model (hMADS). The synthesis of fluorescence probes allowed us to localize these drugs in particular in lipid droplets.