Développement de méthodes de clonage de génomes entiers chez la levure pour la construction de souches châssis semi-synthétiques de Bacillus subtilis.

Development of in-yeast genome cloning methods for the construction of semi-synthetic Bacillus subtilis-derived chassis strains

• Auteur / Autrice : Gabrielle Guesdon
• Direction : Alain Blanchard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie - immunologie
• Date : Soutenance le 29/06/2022
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie du fruit et pathologie
• Jury : Président / Présidente : Matthieu Jules
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Fabien Labroussaa
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sébastien Rodrigue, Fayza Daboussi

Mots clés

Mots clés contrôlés

Saccharomyces

Levure (agent de fermentation)

Génomique

Clonage moléculaire

Bacillus subtilis

Mots clés libres

Bacillus subtilis

Clonage de génome

Ingénierie génomique

Levure

Châssis bactérien

Bacillus subtilis

Genome cloning

Genome engineering

Yeast

Bacterial chassis

Résumé

Un des défis de la biologie de synthèse (BS), est d’apporter des solutions nouvelles à des enjeux globaux majeurs (thérapeutiques/sanitaires, climatiques), en particulier via la construction de souches de production utiles, performantes et respectueuses de l’environnement.Bacillus subtilis (Bsu) est une bactérie Gram+ non pathogène utilisée en biotechnologie comme plateforme de production de molécules d’intérêt. Or, des études récentes ont établi que des souches de Bsu génétiquement modifiées permettaient d’obtenir une plus grande production de protéines recombinantes. Cela suggère que la production de châssis Bsu réduits pourrait être une étape importante dans l’amélioration des souches à visée industrielle.Le projet ANR Bacillus 2.0 dans lequel s’inscrit cette thèse, vise à transposer à Bsu des outils récents du domaine de la BS, et à mettre en place un pipeline efficace pour construire à haut débit des châssis modulables selon l’application biotechnologique. Ce pipeline rassemble les technologies suivantes : (i) design d’un génome synthétique (ii) assemblage de fragments d’ADN chevauchants au sein de la levure Saccharomyces cerevisiae (iii) isolement du génome et transplantation dans une cellule receveuse bactérienne et (iv) sélection et caractérisation des souches mutantes.Les objectifs de cette thèse étaient d’attester la faisabilité de ces méthodes, en tentant de cloner et maintenir le génome réduit de Bsu MPG192 (2,86 Mb) dans la levure, puis de le modifier avec les outils d’ingénierie disponibles chez S. cerevisiae. Dans un premier temps des stratégies déjà décrites dans la littérature ont été déployées afin de cloner le génome entier de Bsu, mais sont restées infructueuses. En nous basant sur une approche de TAR-Cloning, nous avons tenté de cloner plusieurs fragments obtenus par restriction du génome de Bsu. Initialement, seuls cinq fragments sur sept ont été clonés. L’incapacité à cloner le plus grand de ces fragments (1,50 Mpb) est vraisemblablement due à un manque d’ARS et/ou à sa taille. Concernant le second fragment, un ensemble de facteurs peuvent expliquer notre échec : à nouveau le manque d’ARS mais aussi, la présence de nombreux éléments répétés (7 opérons ribosomiques) ou l’expression délétère de ces gènes. Finalement, d’autres expérimentations ont permis de découper le génome en sous-fragments de tailles variables (6kb à 515kb) et ainsi de cloner en 21 morceaux la totalité du génome de Bsu MGP 192. Le TAR-Cloning imposant des contraintes dans le choix des sites de restriction, une nouvelle méthode de clonage, appelée CReasPy-Fusion, a été développée. Elle combine le système d’édition CRISPR-Cas9 et la fusion entre des sphéroplastes de levure et des cellules bactériennes. Comme preuve de concept, nous avons d’abord travaillé avec six espèces de mycoplasmes, et démontré qu’il est possible de cloner et modifier des génomes entiers. Cette approche a ensuite été transposée à Bsu, validant pour la première fois la fusion entre des sphéroplastes de levure et des protoplastes de bactéries Gram+. Elle a permis la capture précise d’un fragment d’environ 150kb.Bien que le génome entier de Bsu n’ait pas été cloné dans la levure à ce jour, plusieurs éléments critiques ont pu être identifiés. Tout d’abord, ces travaux soulignent l’importance de la méthode de clonage à adopter en fonction de l’organisme avec lequel on travaille. Ensuite, ils mettent en exergue l’existence de facteurs biologiques et techniques qui expliquent les difficultés actuelles et qui devront être pris en compte dans la suite des expérimentations. Enfin, ils ont permis le développement d’une nouvelle technique de clonage appelée CReasPy-Fusion, qui vient étoffer le catalogue des méthodes déjà décrites. Par sa versatilité, elle ouvre des perspectives pour la capture de grands fragments de génome, pour l’élimination de loci problématiques, ou encore, en appui à l’assemblage de fragments synthétiques.

One of the major challenges in the synthetic biology (BS) field, is to provide new solutions to global issues (therapeutic/sanitary or climatic), in particular through the construction of useful, efficient and environmentally friendly production strains.The well-characterized, non-pathogenic, Gram+ bacterium Bacillus subtilis (Bsu), is widely used in industry as a biotechnological workhorse. Recent studies have established that mutant strains with modified genomes are able to produce larger amounts of recombinant proteins. This suggests that the production of rationally designed Bsu chassis could be an important step in the improvement of valuable strains for industrial purposes.This work was performed within the Bacillus 2.0's ANR project, which aims at applying SB tools for Bsu, and at developing an effective pipeline for the high-throughput construction of versatile Bsu chassis strains. Selected SB technologies for the pipeline include (i) the synthetic genome design, (ii) the in-yeast DNA assembly methods using Saccharomyces cerevisiae, (iii) the from-yeast whole genome isolation and transplantation (GT) to a recipient bacteria cell and, (iv) the characterization of recombinant strains.The objectives of this thesis were to ensure the feasibility of these methods using a Gram+ bacterium, by showing, in particular, that it was possible to clone and maintain in S. cerevisiae the genome of a minimal Bsu strain, MPG192 (2.86 Mbp) and to modify it using the large repertoire of yeast genetic tools. Our first attempts to clone the entire Bsu genome into yeast using already described methods failed. Using a TAR-Cloning approach, we then attempted to clone large DNA fragments obtained by restriction of the Bsu genome. In a first experiment, five out of seven fragments were cloned. Difficulties to clone the largest fragment (1.50 Mbp), are presumably related to its size, and/or the lack of ARS elements. Concerning the other fragment, several factors have been proposed to explain the cloning failure: again, an insufficient number of ARS elements, but also, the presence of many repeated sequences (7 ribosomal operons), and/or the deleterious expression of these genes. Finally with other experiments, the whole 2.86 Mb genome was cloned in 21 pieces ranging from 6 kbp to 515 kbp. As TAR-Cloning imposes constraints in the choice of restriction sites, a new cloning method, called CReasPy-Fusion, was developed. This method allows the simultaneous cloning and engineering of mega-sized genome in yeast using the CRISPR-Cas9 system, after direct bacterial cell to yeast spheroplast cell fusion. As a proof of concept, we demonstrated that the method can be used to capture a piece of genome, or to clone and edit the whole genome from six different Mycoplasma species. This method was then adapted to Bsu, showing for the first-time yeast spheroplast and Gram+ protoplast cell fusion. A fragment of ~150 kb has been successfully cloned in yeast.Even if, the entire Bsu genome has not yet been cloned in yeast, several critical elements have been identified. First of all, this work underlines the importance of the cloning method to be adopted depending on the organism of interest. Then, it emphasizes the existence of both biological and technical factors that explain current difficulties and that will have to be taken into account in subsequent experiments. Finally, it enabled the development of the new in-yeast cloning method called CReasPy-Fusion which expands the catalog of technics already described. Through its versatility, it opens up prospects for the capture of large genome fragments, the suppression of problematic loci, and to support the assembly of synthetic fragments.