Étude de la pharmacologie moléculaire et de la régulation du canal TRPV1 à l’aide de la technique du transfert d’énergie en résonance de bioluminescence (BRET)

Study of the molecular pharmacology and regulation of the TRPV1 channel using the technique of bioluminescence resonance energy transfer (BRET)

• Auteur / Autrice : Yann Chappe
• Direction : Yann Percherancier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 22/03/2022
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de l'intégration du matériau au système (Talence, Gironde)
• Jury : Président / Présidente : Laurent Groc
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yann Percherancier, Laurent Groc, Céline Galès, Florian Lesage, Dimitra Gkika, Aubin Penna
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Céline Galès, Florian Lesage

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bioluminescence

Canaux ioniques

Transfert d'énergie

Pharmacologie moléculaire

Mots clés libres

Pharmacologie moléculaire

Transfert d'énergie en résonance

Canaux ioniques

Bioluminescence

Molecular Pharmacology

Resonance Energy Transfert

Ions channels

Bioluminescence

Résumé

Malgré leur potentiel en tant que cible thérapeutique, moins de 20% des canaux ioniques sont actuellement exploités pour chercher de nouveaux médicaments. Pour le criblage à haut débit (HTS) des canaux ioniques, le patch-clamp automatisé (APC) est la technique de référence, mais il permet un débit moyen, reste coûteux et nécessite une manipulation experte. Pour les étapes précoces de criblage de médicaments, les sondes à fluorescence sont souvent préférées et confirmées ultérieurement par APC. Ces techniques mesurent des événements moléculaires distants spatialement et temporellement du canal étudié, ce qui favorise une fréquence élevée de faux positifs. Cet inconvénient peut être contourné en mesurant les événements à proximité du canal ionique étudié. Au cours des vingt dernières années, les approches basées sur le transfert d'énergie par résonance (RET) ont offert de nouvelles opportunités pour sonder l'activité d'une liste toujours croissante de protéines dans les cellules vivantes, en temps réel. Ces techniques s’appuient sur le transfert d'énergie non-radiatif entre un donneur d'énergie et un accepteur d'énergie fluorescent compatible. Un tel mécanisme quantique repose strictement sur la proximité moléculaire (environ 100 Å) et l'orientation entre les molécules donneuses et acceptrices pour le transfert d'énergie. Il s'agit d'un système de choix pour mesurer la dynamique des interactions et des changements de conformation des protéines. Parmi les différentes techniques RET, le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence (BRET) est une méthode accessible et abordable, qui est de plus en plus largement utilisée pour étudier l'activité des protéines dans les systèmes vivants. L'élimination du besoin d'une source de lumière externe pour l'excitation des donneurs donne au BRET certains avantages par rapport aux techniques connexes telles que le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET). Grâce à ces avantages, le test BRET a été largement mis en œuvre pour étudier l’activité des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et des kinases. L’objectif de cette thèse est de développer plus avant l’utilisation de la technique de BRET pour l’étude fonctionnelle et pharmacologique des canaux ioniques dans les cellules vivantes. Grâce à diverses sondes BRET intra- et inter- moléculaires, nous avons réalisé le suivi dynamique de l’activité et de la régulation du canal TRPV1 à divers niveaux, en mesurant : (i) les changements conformationnels, (ii) le couplage avec l’un de ses partenaires fonctionnels la Calmoduline (CaM), (iii) la concentration d’ion proximal situé sous le canal et iv) sa distribution subcellulaire. Ces différents modes de lectures permettent d’éclairer la pharmacologie de TRPV1 sous un nouveau jour en nous donnant accès à des paramètres qu’il n’est pas possible de mesurer à l’aide de techniques conventionnelles comme la patch-clamp ou les sondes à fluorescence. Les sondes BRET mesurant les changements de conformation de TRPV1 et son couplage à la CaM ont été évaluées en tant que nouvelle méthode HTS en criblant la banque Prestwick, une bibliothèque chimique de petite taille avec une grande diversité structurelle, à la recherche de composés agonistes et antagonistes de TRPV1. L’analyse multiparamétrique résultante a permis de montrer la capacité des inhibiteurs de la CaM à moduler l’activation chimique de TRPV1. Une analyse plus poussée de ce phénomène a mis en exergue l’importance du couplage fonctionnel de TRPV1 avec la CaM pour le maintien de TRPV1 à la membrane plasmique. Enfin, dans un dernier volet, nous montrons que certains ligands peuvent moduler la sélectivité cationique au travers du canal TRPV1 et de certains canaux P2X. Ceci représente une opportunité thérapeutique potentielle pour cibler des voies spécifiques qui ne produisent que les effets attendus, tout en évitant les effets indésirables induits par les différentes cascades de signalisation.

Ion channels are essential proteins for the proper functioning of cell physiology and involved in a wide range of functions. They are in fact interesting drug targets for many therapeutic applications. Despite this potential, the pharmacological profiling of most ion channels remains unaddressed. For high-throughput screening (HTS) of ion channels, the automated patch- clamp technique (APC) is the gold standard, but it provides medium throughput, remains expensive, and requires expert handling. For early stages of drug screening, indirect readout technologies are often preferred, later confirmed by APC. These techniques monitor molecular events that are spatially and temporally distant from the studied channel, promoting a high frequency of false positives. This drawback can be bypassed by measuring proximal events near the studied ion channel once activated. Over the past twenty years, approaches based on resonance energy transfer (RET) have offered new opportunities to probe the activity of an ever-growing list of proteins in living cells, in real time. These techniques are based on non-radiative energy transfer between an energy donor and a compatible fluorescent energy acceptor. Such a quantum mechanism strictly relies on molecular proximity (about 100 Å) and orientation between donor and acceptor molecules for energy transfer. It is a system of choice for monitoring both constitutive and regulated inter and intramolecular interactions. Among the various RET techniques, bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a popular method to study protein activity in living systems. Eliminating the need for an external light source for donor excitation, gives BRET certain advantages over related techniques such as fluorescence resonance energy transfer (FRET). Thanks to these advantages, the BRET test has been widely implemented for G-protein-coupled receptor (GPCR) and kinase screening. The objective of this thesis is to use the BRET technique, and apply it to the functional and pharmacological study of ion channels in living cells and in real time by designing BRET probes targeting these channels. Thanks to these probes, we evaluated the activity and regulation of the TRPV1 channel, by monitoring (i) ion channel conformational changes during gating, (ii) the coupling with one of its functional partners, the Calmodulin (CaM) protein, (iii) the proximal ion concentration near the channel pore and iv) its subcellular distribution. These events are of critical importance for TRPV1 pharmacology but remained intractable using standard HTS techniques for ion channels such as APC or automated calcium assay. The BRET probes targeting TRPV1 conformational changes and functional coupling with CaM were evaluated as novel HTS methods by screening the Prestwick library, a small chemical library with high structural diversity, for both agonists and antagonists. The resulting multiparametric analysis demonstrated the ability of CaM inhibitors to modulate chemical activation of TRPV1. Further analysis of this phenomenon highlighted the importance of functional coupling of TRPV1 with CaM for the maintenance of TRPV1 at the plasma membrane. Finally, in a last part, we show that some ligands can differentially modulate the cationic selectivity through the TRPV1 channel and some P2X channels. Biased ligand activity in ion channel represents a potential therapeutic opportunity to target specific pathways that produce only the expected effects, while avoiding ligand adverse effects.