Développement d'une méthode de couplage FFF multi-détection pour la caractérisation de la fraction macromoléculaire impliquée dans l'astringence des vins rouges

Development of a multi-detection FFF coupling method for the characterisation of the macromolecular fraction involved in the astringency of red wines

• Auteur / Autrice : Kevin Pascotto
• Direction : Frédéric Violleau, Véronique Cheynier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences des Agroressources
• Date : Soutenance le 12/04/2021
• Etablissement(s) : Toulouse, INPT
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la Matière (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Chimie Agro-industrielle (Toulouse ; 1995-....)
• Jury : Président / Présidente : Christian Chervin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Frédéric Violleau, Véronique Cheynier, Christian Coelho
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Gaëtane Lespes, Victor de Freitas

Mots clés

Mots clés contrôlés

Vin rouge

Polysaccharides

Tanins

Polyphénols

Mots clés libres

Polyphénols

Tanins

Polysaccharides

Macromolécules

Vin rouge

Astringence

Fractionnement par couplage flux force

Polyphenols

Tanins

Polysaccharides

Macromoleculs

Red wine

Astringency

Flow fractionation

Résumé

Le vin rouge est une matrice complexe contenant des macromolécules telles que les polyphénols et les polysaccharides. Ces macromolécules et leurs interactions exercent un impact sur les propriétés gustatives telle que l’astringence. Les polyphénols des vins comprennent en particulier les tanins condensés ou proanthocyanidines extraits du raisin mais aussi de nombreux dérivés formés au cours de la vinification et du vieillissement des vins. L’astringence qui résulte des interactions des tanins avec les protéines salivaires augmente avec leur concentration et leur masse molaire. Par ailleurs, il a été montré que les polysaccharides (PS) réduisent la perception d'astringence dans les vins, probablement du fait des interactions entre PS et polyphénols. Classiquement, la structure et la masse molaire moyenne des tannins sont déterminées après dépolymérisation. Cependant ces méthodes sont peu adaptées aux structures de tanins évoluées telles qu’on les retrouve dans le vin et ne donnent pas accès à la distribution des masses molaires. Des techniques de chromatographie d’exclusion stérique ont été développées pour l’analyse de la distribution des masses molaires des polyphénols et des PS mais elles ne permettent pas d’analyser ces composés simultanément ni de détecter leurs complexes. L’Asymmetrical Flow Field – Flow Fractionation (AsFlFFF) permet de séparer les molécules en fonction de leur rayon hydrodynamique ainsi que les complexes macromoléculaires sans les dégrader. Le couplage avec la détection MALS permet de déterminer le rayon de gyration des molécules et, en association avec un réfractomètre différentiel (dRI) leur masse molaire. Le couplage avec la spectrophotométrie UV-visible permet la détection quantitative des composés phénoliques. Cette technique a déjà été utilisée pour caractériser des composés phénoliques purifiés ou les macromolécules dans la bière et le vin blanc mais elle n’a jamais été appliquée au vin rouge. L'objectif de cette recherche était d'abord de mettre au point les conditions d'analyse pour fractionner les macromolécules et les complexes du vin rouge dans leur état natif et les caractériser à l'aide d'un système de détection multiple (UV-vis -MALS -dRI). Une solution imitant la matrice du vin a été utilisée comme phase mobile pour limiter la dégradation des complexes présents dans le vin rouge. Nos résultats montrent que la fraction macromoléculaire du vin analysable par AsFlFFF ne représente que quelques pourcents des composants du vin qui contribuent à son absorption dans l’UV. Le profil de séparation obtenu a été divisé en quatre fractions. Grâce à l’injection d’extraits de tanins et de PS dans le système et à l’analyse des fractions de vin collectées, les trois premières ont été attribuées à des tanins, coelués avec des PS de faible masse molaire (F1), à des PS de masse molaire intermédiaire (F2) et à des PS de masse molaire élevée (F3). De plus, la présence de matériau absorbant l’UV dans les fractions F2 et F3 suggère la présence de protéines ou de polyphénols interagissant avec ces polysaccharides et/ou les protéines. En revanche, la dernière fraction (F4) pourrait correspondre à de très gros objets mais n’a pas totalement été identifiée. Cette méthode a été utilisée pour explorer les relations entre les fractogrammes AsFlFFF-UV-vis -MALS -dRI et les notes d'astringence d’une série de vins qui ont été dégustés par un panel sensoriel. Cette étude a montré que les vins les plus astringents sont caractérisés par de fortes concentrations de polyphénols de haute masse molaire. En revanche, les vins les moins astringents ont montré les plus hautes teneurs en PS dans F2 et F3, confirmant que l'astringence perçue est contrecarrée par le matériel polysaccharidique. Ces résultats ont également montré que la masse molaire des PS est associée à l'assouplissement de l'astringence. En revanche, les variables relatives à F4 ont une contribution négligeable à l'astringence du vin.

Red wine is a complex matrix containing macromolecules such as polyphenols and polysaccharides. These macromolecules and their interactions have an impact on taste properties such as astringency. Wine polyphenols include condensed tannins or proanthocyanidins extracted from the grapes but also many derivatives formed during winemaking and aging. Astringency results from tannin interactions with salivary proteins and increases with their concentration and molecular weight. In addition, polysaccharides (PS) have been shown to reduce the perception of astringency in wines, probably due to their interactions with polyphenols. Classically, the structure and average molecular weight of tannins are determined by HPLC after depolymerization. However, these methods are not appropriate for evolved tannins as found in wine and do not give access to molecular weight distribution. Steric exclusion chromatography techniques have been developed for determination of molecular weight distribution of polyphenols and PS but common protocols allow neither their simultaneous analysis nor detection of their complexes. The Asymmetrical Flow Field– Flow Fractionation (AsFlFFF) separates molecules according to their hydrodynamic radius as well as macromolecular complexes without degrading them. Its coupling with Multiple Angle Light Scattering (MALS) detection allows determination of the radius of gyration of molecules and, in combination with a differential refractorometer (dRI) of their molecular weight. Coupling with UV-visible spectrophotometry allows quantitative detection of phenolic compounds. This technique has already been used to characterize purified phenolic compounds or maromolecules in beer and white wine but has never been applied to red wine. The objective of this research was first to develop the analytical conditions to separate the macromolecules and red wine complexes in their native state and characterize them using a multiple detection system (UV-vis -MALS -dRI). A wine like solution was used as mobile phase to limit the degradation of the complexes present in red wine. our results show that the macromolecular fraction of wine analyzed by AsFlFFF represents only a few percent of the wine components that contribute to UV absorption. The AsFlFFF separation profile was divided into four fractions. Owing to the injection of tannin and PS extracts into the system and the analysis of fractions collected after analysis of different wines, the first three were attributed to tannins coeluted with lower molecular weight PS (F1), intermediate molecular weight PS (F2) and higher molecular weight PS (F3). In addition, the presence of UV-absorbing material in F2 and F3 fractions suggests the presence of proteins or of polyphenols interacting with these polysaccharides. The last fraction (F4) likely corresponds to very large objects but has not been characterized. This method was used to explore the relationships between AsFlFFF-UV-vis - MALS-dRI fractograms and the astringency scores of a series of red wines which were tasted by a sensory panel. This study showed that the most astringent wines are characterized by high concentrations of higher molecular weight polyphenols while the less astringent wines showed the highest PS contents in F2 and F3, confirming that the perceived astringency is counteracted by polysaccharidic material. These results also showed that the higher molecular weight PS are particularly associated with astringency softening. The variables related to F4 had no impact on red wine astringency.