Etude des mécanismes de résistance aux inhibiteurs de FLT3 dans les leucémies aigues myéloïdes

Study of resistance mechanisms of FLT3 inhibitors in acute myeloïd leukemia

• Auteur / Autrice : Fetta Mazed
• Direction : Jérôme Tamburini-Bonnefoy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Hématologie et oncologie
• Date : Soutenance le 22/03/2019
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Cochin (Paris ; 2002-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Nadine Varin-Blank
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jérôme Tamburini-Bonnefoy, Nadine Varin-Blank, Julie Guillermet-Guibert, Paulo De Sepulveda
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Julie Guillermet-Guibert, Paulo De Sepulveda

Mots clés

Mots clés contrôlés

Systèmes CRISPR-Cas

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats

CRISPR (génétique)

Résistance aux médicaments

Inhibiteurs des tyrosine kinases

Mots clés libres

FLT3-ITD

RSK2

Kinome

Résumé

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) constituent un groupe hétérogène d’hémopathies malignes résultant de la prolifération clonale d’un progéniteur myéloïde bloqué dans sa différenciation. De pronostic globalement défavorable, dépend de l’âge et de facteurs cytogénétiques et moléculaires. La mutation du gène FLT3 de type duplication en tandem du domaine juxta-membranaire (ITD : internal tandem duplication) est détectée dans 30% des échantillons de LAM, corrèle à une fréquence accrue de rechutes et à un pronostic défavorable. La mutation ITD conduit à une activation dérégulée et constitutive de récepteur FLT3, induisant une addiction oncogénique des cellules leucémiques aux voies de signalisation en aval, désignant FLT3 comme cible thérapeutique pertinente dans les LAM. Ainsi, de nombreux inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) ciblant FLT3 ont été développés, certains ayant une efficacité significative en monothérapie et améliorant la survie des patients ayant une mutation FLT3-ITD en association aux traitements conventionnels. Néanmoins, la plupart des patients traités en monothérapie, et une proportion importante de ceux traités en association rechutent en raison de mécanismes de résistance développés par la cellule pour échapper à l’action des ITK. L’étude de ces mécanismes est un enjeu essentiel afin d’améliorer l’efficacité des traitements dans les LAM FLT3-ITD. C’est cette thématique que j’ai souhaité aborder au cours de ma thèse. Nous avons tout d’abord, mis en évidence par des approches transcriptomiques et protéomiques une nouvelle cible de PIM2, la sérine thréonine kinase RSK2, ayant un rôle dans le contrôle de l’apoptose des cellules de LAM. Mes collègues et moi-même avons montré que RSK2 était fortement diminuée suite à l’invalidation de PIM2 par interférence ARN dans une lignée de LAM FLT3-ITD (MOLM-14), tant au niveau ARNm que protéique. Par une technique de sensibilisation à l’apoptose à l’aide de peptides BH3 ainsi que par un inhibiteur de Bcl-2, le composé ABT-199, nous avons montré le rôle de RSK2 dans le contrôle de l’apoptose mitochondriale en contexte FLT3-ITD. Nous avons ensuite observé que la surexpression de RSK2 compensait la mort cellulaire induite par l’invalidation de PIM2, renforçant ainsi le rôle de cette nouvelle voie dans le contrôle de la survie cellulaire. Finalement, nous avons suggéré dans des modèles murins de la maladie que RSK2 pourrait participer à la résistance aux ITK ciblant FLT3. Afin de poser la question de ces mécanismes de résistance sans à priori, j’ai adapté à notre modèle de LAM une banque CRISPR pan-génomique dans le but de la cribler avec différents ITK et mettre à jour de nouveaux mécanismes de résistance aux ITK. J’ai utilisé l’enzyme dCas9 permettant non pas des cassures de l’ADN mais une modulation de la transcription de gènes cibles, soit une répression lors de la fusion au corépresseur KRAB (CRISPRi), soit une activation lors de la fusion à VP64 (CRISPRa). La dCas9 et les banques ont été transduites par des lentivirus dans 2 lignées FLT3-ITD (MOLM-14 et MV4-11). Ces cellules ont été amplifiées en culture liquide ou sur des cellules stromales mésenchymateuses (MSC) et traitées soit par du DMSO soit par l’un des 3 ITK ciblant FLT3 suivants : quizartinib, midostaurine ou ponatinib. L’identification et la quantification des ARN guides par séquençage haut débit et l’analyse bioinformatique nous renseigne enfin sur les gènes dont la répression favorise l’effet des ITK, pouvant ainsi représenter de nouveaux mécanismes de résistance intrinsèques (culture liquide) et/ou extrinsèques (co-culture MSCs) à la cellule. Le troisième axe de mon travail a porté sur la caractérisation des modifications du profil de signalisation global induites par les mutations du domaine tyrosine kinase (TKD) de FLT3-ITD impliquées dans la résistance aux ITK.

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous group of hematological malignancies resulting from the clonal proliferation of a myeloid progenitor blocked in its differentiation. The prognosis of AML is generally unfavorable, depending on age, cytogenetic and molecular factors. The FLT3-ITD mutation, (internal tandem duplication) is detected in 30% of AML patients and correlates with an increased frequency of relapses and an unfavorable prognosis. FLT3-ITD mutations leads to a deregulated and constitutive activation of FLT3 receptors, inducing an oncogenic addiction of leukemic blasts to FLT3-dependent signaling pathways, pinpointing FLT3 as a relevant therapeutic target in AML. Thus, many tyrosine kinase inhibitors (TKI) targeting FLT3 have been developed, some of which harboring significant efficacy in monotherapy and even improving patients’ survival when combined with conventional treatments. However, most patients treated by TKI monotherapy, and a significant proportion of those treated with combined approaches will relapse, due to various escape mechanisms. To study these mechanisms is therefore a major goal to improve the efficacy of treatments in FLT3-ITD LAM which I undertook during my thesis. First, I built on my team’s previous work to discover a new target of PIM2, the RSK2 serine threonine kinase, using transcriptomic and proteomic approaches. We showed that RSK2 expression was greatly decreased following the invalidation of PIM2 by RNA interference in a FLT3-ITD AML line (MOLM-14), both at the mRNA and protein levels. By BH3 profiling, we connected RSK2 to the control of mitochondrial apoptosis in the context of FLT3-ITD cells. We then observed that RSK2 overexpression compensated apoptosis induced by PIM2 knockdown, thus reinforcing the role of this new PIM2/RSK2 pathway in the control of cell survival. Finally, we suggested that RSK2 may be involved in TKI resistance in mouse models of AML. To address the question of FLT3-ITD resistance mechanisms more broadly, I adapted a CRISPR/dCas genome wide library on our AML model, with the purpose of screening it with different TKI to unravel new mechanisms of resistance to these compounds. I used the dCas9 enzyme, devoid of endonuclease activity but modulating target genes expression; inhibition in case of dCas9/KRAB fusion (CRISPRi), or activation in dCas9/VP64 fusion (CRISPRa). Both dCas9 and libraries were transduced by lentiviruses in two FLT3-ITD cell lines (MOLM-14 and MV4-11), grown in liquid culture or on a mesenchymal stromal cells (MSC) layer, and treated either with DMSO or with one of the 3 following ITKs: quizartinib, midostaurine or ponatinib. The identification and quantification of RNAs guides by high-throughput sequencing and bioinformatic identify potential new mechanisms of intrinsic resistance (liquid culture) and / or extrinsic (co-culture MSCs) to TKI. The third area of my work focused on the characterization of global signaling changes induced by FLT3-ITD tyrosine kinase domain (TKD) mutations associated with TKI resistance.