Contribution à la compréhension et à la prévention de la mort massive des cellules souches mésenchymateuses post-implantation : application à l'ingénierie tissulaire

Contribution to understanding and preventing mesenchymal stem cells massive death postimplantation : tissue-engineering applications

• Auteur / Autrice : Cyprien Denoeud
• Direction : Hervé Petite, Esther Potier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Biothérapies et biotechnologies
• Date : Soutenance le 30/09/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Bioingénierie et Biomécanique Ostéo-articulaires (B2OA) (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Denis Lourdin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Hervé Petite, Esther Potier, Denis Lourdin, Astrid Watrin-Pinzano, Catherine Levisage
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Astrid Watrin-Pinzano, Catherine Levisage

Mots clés

Mots clés contrôlés

Glucan 1,4-alpha-glucosidase

Amidons

Nanogels

Métabolisme

Glucose

Ischémie

Mort cellulaire

Génie tissulaire

Cellules stromales mésenchymateuses

Mots clés libres

Survie cellulaire

Fonctionnalité cellulaire

Cell survival

Cell paracrine functions

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) apparaissent comme des candidates idéales en ingénierie tissulaire. De plus en plus d’essais cliniques utilisent aujourd’hui cette source cellulaire dans l’objectif de réparer des tissus ou organes lésés afin de restaurer leur fonction. Cependant, une fois implantées, les CSMs meurent rapidement et massivement, réduisant considérablement le succès de cette approche thérapeutique. Bien que cette mort massive soit multifactorielle, l’environnement ischémique (caractérisé entre autre, par la déplétion en oxygène et en nutriments) dans lequel les cellules sont confrontées une fois implantées, semble être la cause principale. De plus, le facteur limitant la survie cellulaire au sein de cet environnement avasculaire est de façon surprenante, non pas l’absence d’oxygène, mais l’absence de glucose. Toutefois, les voies métaboliques utilisées par les CSMs après implantation afin de convertir le glucose en énergie ne sont, à ce jour, que peu comprises. De plus, aucune stratégie basée sur l’apport continu de glucose aux cellules n’a été jusqu’à présent établie afin d’améliorer la survie, et par conséquent, la fonctionnalité des CSMs après implantation. La première étude de ce projet de doctorat vise à comprendre davantage le métabolisme énergétique emprunté par le glucose au sein des CSMs après implantation. Nous avons démontré que les conditions quasi-anoxiques (0.1% pO2) associées à l’absence de glucose et de sérum reflètent au mieux in vitro le microenvironnement d’implantation in vivo. Au sein de cet environnement, les CSMs produisent leur énergie sous forme d’ATP exclusivement via la glycolyse anaérobie à partir d’un unique substrat, le glucose. Or, le glucose manque dans cet environnement ischémique et les CSMs possèdent des réserves glycolytiques très limitées qu’elles vident en 24 heures, puis consomment la totalité de leurs réserves d’ATP en 3 jours, entrainant une mort cellulaire massive et rapide.La seconde (et principale) étude consiste à développer et à évaluer une stratégie basée sur l’apport continu de glucose pour améliorer la survie et la fonctionnalité des CSMs après implantation. Nous avons, pour la première fois, apporté la preuve de concept qu’un hydrogel nutritif, composé d’un système de polymère de glucose (amidon) et d’une enzyme (amyloglucosidase), ayant préalablement fait l’objet d’un brevet (EP 14306700), permet d’améliorer la survie de CSMs pendant 14 jours, à la fois au sein d’un modèle ischémique in vitro ainsi que dans un modèle ectopique post-implantation. De plus, ce dispositif innovant permet d’améliorer les fonctions paracrines des CSMs, augmentant notamment la néovascularisation jusqu’à 21 jours après implantation. En augmentant la survie et la fonctionnalité des CSMs après implantation grâce à un apport continu en glucose, l’hydrogel nutritif composé d’amidon et d’AMG apparait comme une stratégie d’intérêt pour améliorer les résultats thérapeutiques des produits à base de cellules souches en ingénierie tissulaire.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are appealing candidates for regenerative medicine applications. Today, MSCs are more and more using to clinical trials for repairing injured tissues or organs. Upon implantation, however, cells encounter an avascular microenvironment depleted of oxygen and nutrients that is responsible for their massive death post-transplantation, a major roadblock to successful clinical therapies. This issue can be overcome by in situ supplying glucose that acts as the main metabolic fuel for MSCs in hypoxia and enhances their survival and functionality. However, energy-providing pathways used by MSCs upon transplantation and their plausible metabolic switches in response to this ischemic environment are not well understood. Moreover, any strategy, based on continuous glucose delivery to fuel cells, have not been designed for improving MSC survival and functionality post-implantation. The first aim of this PhD project is to better understand the energetic metabolism used by MSCs upon transplantation. We establish for the first time that the in vivo environment experienced by hMSCs is best reflected by near-anoxia (0.1% pO2) in vitro associated with glucose and serum depletion. Under this « ischemic » in vitro model, hMSCs rely almost exclusively on glucose through anaerobic glycolysis to produce ATP. Moreover, hMSCs are unable to adapt their energetic metabolism to the lack of exogenous glucose, possess a very limited stock of glucose and no ATP reserves. This lack of downregulation of energy turnover results in a rapid depletion of hMSCs energy reserves, explaining their poor survival rate. The next (and main) aim of this PhD project is to develop and test an enzyme-controlled, nutritive hydrogel with an inbuilt system of glucose delivery to improve MSC survival and functionality. This novel hydrogel, previously based on a patent (EP14306700), is made of both fibrin, starch (a polymer of glucose), and amyloglucosidase (AMG, an enzyme that releases glucose from starch), and provides physiological levels of glucose to fuel MSCs via glycolysis. hMSCS loaded in the novel starch/AMG hydrogel exhibit improved cell viability and paracrine functions for up to 14 days under the “ischemic” in vitro model. Most importantly, in addition to enhanced MSC viability, this nutritive hydrogel promoted paracrine functions when implanted in an ectopic model.Looking forward, and given the current wide interest in the use of stem cells for regenerative medicine applications, the novel inbuilt system of glucose delivery has the potential of improved tissue engineering and regenerative methodologies, which enhance cell survival and functionality after implantation.