Caractérisation de l'interaction des IgA sécrétoires avec la cellule épithéliale intestinale humaine

Characterization of secretory IgA interactions with human intestinal epithelial cells

• Auteur / Autrice : Roman Goguyer Deschaumes
• Direction : Georgia Malamut
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 25/06/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Renato Costa Monteiro
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Renato Costa Monteiro, Michel Cogné, Stéphane Paul, Nadine Cerf-Bensussan, Bertrand Meresse
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Michel Cogné, Stéphane Paul

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules épithéliales

Immunoglobuline A

Maladie coeliaque

Mots clés libres

Immunoglobuline A (IgA)

Récepteur à la transferrine (CD71)

Épithélium intestinal

Glycolipides

Secretory Carrier Membrane protein 3 (SCAMP3)

Maladie cœliaque

Récepteur de surface

Immunologie des muqueuses

Immunoglobulin A (IgA)

Transferrin receptor (CD71)

Intestinal epithelium

Glycolipids

Secretory Carrier Membrane protein 3 (SCAMP3)

Celiac disease

Cell surface receptor

Mucosal immunology

Résumé

La maladie cœliaque (CeD) est une entéropathie chronique induite par le gluten alimentaire chez des individus génétiquement prédisposés. Lors de leur absorption par les entérocytes, les peptides de gliadine sont dégradés et perdent leur immunogénicité. Des travaux antérieurs de notre laboratoire ont suggéré que des IgA sécrétoires spécifiques (SIgA) pourraient permettre de transporter les peptides de gliadine traversant l'épithélium intestinal en se liant au récepteur de la transferrine (CD71). Bien que confirmant la colocalisation des SIgA avec CD71 sur la lignée cellulaire colique Caco-2, nos travaux récents ont exclu le CD71 comme récepteur direct des SIgA purifiées du colostrum. Grâce à l'utilisation de cellules déficientes pour UGCG, MGAT1 ou COSMC, trois enzymes respectivement impliquées dans la biosynthèse des glycolipides, des N-glycosylations et des O-glycosylations, la contribution des glycolipides membranaires à la fixation des SIgA a pu être montrée. Cette dernière se fait parallèlement à une fixation à un ou plusieurs récepteurs protéiques, sensibles à un traitement de surface par des protéases. L'étude de la fixation des SIgA sur une puce présentant 300 motifs de glycanes a confirmé le rôle des glycolipides dans la fixation des SIgA et permis d'identifier des partenaires glycolipidiques préférentiels : les globosides (Gb3 et Gb4), isoglobosides (iGb3 et iGb4) et néolactosides. Afin de déterminer si les SIgA se fixent à un récepteur protéique unique, des cellules Caco-2 ont été transduites avec une bibliothèque CRISPR qui cible 19050 gènes du génome humain. Les cellules pour lesquelles la fixation des SIgA est altérée ont été isolées par tri cellulaire et les guides enrichis analysés par séquençage à haut débit. Si la validité de l'approche expérimentale a bien été vérifiée par l'utilisation de la beta-2-microglobuline comme contrôle positif, aucun récepteur des SIgA n'a pu être identifié. Ce résultat suggère que plusieurs récepteurs pourraient contribuer à la fixation des SIgA, la perte de l'un d'entre eux n'étant pas suffisante pour altérer significativement celle-ci. Parallèlement, des expériences d'immunoprécipitation des SIgA combinées à une analyse par spectrométrie de masse, ont permis l'identification de SCAMP3. Bien que l'inactivation de SCAMP3 par la technique CRISPR-Cas9 n'altère pas la fixation des SIgA, nos résultats indiquent que SCAMP3 est un partenaire de CD71 et participe à la formation du complexe CD71/SIgA. La proximité des partenaires a été confirmée par un test de ligation de proximité et par FRET sur les cellules Caco-2, et le recrutement de SCAMP3 a été confirmé sur les biopsies duodénales de malades cœliaques actifs. SCAMP3 pourrait ainsi participer au transport protégé des SIgA à travers l'épithélium duodénal.

Celiac disease (CD) is a chronic enteropathy induced by dietary gluten in genetically predisposed individuals. When absorbed by enterocytes, gliadin peptides are degraded and lose their immunogenicity. Previous work in our laboratory has suggested that specific secretory IgA (SIgA) could mediate gliadin peptides crossing the intestinal epithelium by binding to the transferrin receptor (CD71). Although confirming the colocalization of CD71 SIgA on Caco-2, a colonic cell line, our recent findings have excluded CD71 as a direct receptor for purified colostrum SIgA. By using cells deficient for UGCG, MGAT1 or COSMC, three enzymes respectively involved in the biosynthesis of glycolipids, N-glycosylations and O-glycosylations, the contribution of membrane glycolipids to SIgA binding was highlighted. The latter occurs in parallel with binding to one or several protein receptors, which is sensitive to surface treatment with proteases. The role of glycolipids in SIgA binding was confirmed by the study of SIgA binding on an array with 300 glycan units, which enabled the identification of preferential glycolipid partners: globosides (Gb3 and Gb4), isoglobosides (iGb3 and iGb4) and neolactosides. In order to determine whether SIgA bind to a single protein receptor, Caco-2 cells were transduced with a CRISPR library that targets 19050 genes in the human genome. Cells for which SIgA binding is altered were isolated by cell sorting and the enriched guides analyzed by next-generation sequencing. Although the validity of the experimental approach was verified by using beta-2-microglobulin as a positive control, no SIgA receptors could be identified. This result suggests the contribution of several receptors, and the loss of one of them may not significantly alter SIgA binding. In parallel, SIgA immunoprecipitation experiments combined with mass spectrometry analysis allowed the identification of SCAMP3. Although inactivation of SCAMP3 by the CRISPR-Cas9 technique does not alter SIgA binding, SCAMP3 was identified as a partner of CD71 which participates in the formation of the CD71/SIgA complex. Proximity of partners was confirmed by a proximity ligation test and by FRET on Caco-2 cells, and SCAMP3 recruitment was confirmed on duodenal biopsies of active celiac patients. SCAMP3 could thus participate in the protected transport of SIgA through the dudodenal epithelium.