Stratégies analytiques pour la détection de facteurs de croissance par spectrométrie de masse dans le cadre de la lutte anti-dopage

by Cynthia Mongongu (Truong)

Thesis project in Toxicologie

Under the supervision of Francois Coudore, Alexandre Marchand and Corinne Buisson.

Ongoing thesis at Paris Saclay , under the authority of Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , in a partnership with Agence Française de Lutte contre le Dopage (laboratoire) and Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) since 15-12-2016 .

  • Alternative Title

    Analytical strategies for the detection of growth factors by mass spectrometry in the context of anti-doping


  • Abstract

    Peptide hormones, growth factors and similar substances are misused from their primary use for doping purposes. They have various effects on the improvement of exercice performance and are therefore prohibited by the World Anti-Doping Agency. These substances are suspected to be used by athletes to increase their performance, either directly by a proven ergogenic effect or indirectly by trophic or metabolic effects. Doping in sports is a rapidly evolving field and athletes are following very closely therapeutic innovations. Moreover they can purchase many substances on the black market nowadays, even copies of future drugs still under investigations. In this regard, it is essential for antidoping laboratories to implement analytical methodologies allowing detection of these substances, to survey and prevent the use of these substances by athletes. The aims of the project are: - Detection of IGF-I Some growth factors, such as IGF-I (Insulin-like Growth Factor I) involved in protein synthesis and blood glucose regulation, play an important role in the control of muscle mass. IGF-I, a peptide hormone mainly synthesized in the liver, is stimulated by growth hormone (GH). As a result, it can be used as a biomarker of GH intake. IGF-I circulates in serum linked to carrier proteins, IGF-BPs. These proteins act as transporter protein and regulate the bioavailability of IGF-1 at a systemic and local level. Only the free form, dissociated from the IGF-BPs, is bioactive. The dosage of IGF-1 has been particularly studied and many studies report the analysis of IGF-I by mass spectrometry. The assay is a delicate procedure, given the high affinity of IGF-I for IGF-BPs. Several techniques are used to release IGF-I from its binding proteins: ultrafiltration, solid phase extraction, acid-alcohol extraction or dissociation by addition of IGF-II. The World Anti-Doping Agency has proposed to the anti-doping laboratories to implement a mass spectrometric analysis via a bottum-up approach which consists of a quantification of peptides after a tryptic digestion of IGF-I. One major goal of the thesis will be to developp a top-down analysis method and comparing to existing methods. If a partnership is possible with another anti-doping laboratory, an interlaboratory study may be carried out to verify the reproducibility and robustness of the proposed analysis method. - Detection of IGF-I analogues The synthetic analogues of IGF-I will also be targeted in this work. Indeed, in order to allow the physiological actions of IGF-I, some laboratories have modified the primary structure of IGF-I and synthesized analogues such as Des (1-3) -IGF1 and LongR3-IGF –I. These substances have a reduced affinity for binding proteins in the blood. Thus, they have a greater bioavailability in the target tissues. They are used by some athletes who establish protocols of administration by intramuscular injection. To this, no data on human administration is available. As a result, an experimental administration of analogues (similar to that used by athletes) will be performed on a mouse model. The Blood samples and / or urine collected after administration of analogs will be analyzed to study the kinetics of elimination, to determine the window of detection and the effect on physical performance. In vitro studies (human hepatocytes) will also complete the study. The other major goal of the thesis will be to develop a sensitive and reproducible method .This will be achieved by studying samples from anti-doping control of athletes that gave their consent to use their samples for research. Similarly to IGF-I, if a partnership is possible with another laboratory, an interlaboratory study can be carried out.


  • Abstract

    Les hormones peptidiques, les facteurs de croissance et substances analogues détournés de leur usage premier pour dopage exercent des effets variés sur l'amélioration des performances et font partie, de ce fait, des substances dont l'usage est prohibé par l'Agence Mondiale Anti-Dopage. Ces molécules sont en effets suspectées d'être utilisées par les athlètes pour augmenter leurs performances, soit directement par un effet ergogénique avéré ou qui reste encore à explorer, soit indirectement par des effets trophiques ou métaboliques. Les sportifs suivent de près les innovations thérapeutiques pouvant leur permettre d'améliorer leurs performances et arrivent même à se procurer par le marché noir les substances en cours de développement. Les laboratoires anti-dopage doivent donc mettre en place des méthodes de détection permettant de réaliser une veille sur ces produits et d'identifier leur utilisation éventuelle à des fins de dopage. 1. Détection d'IGF-I Certains facteurs de croissance tels qu'IGF-1 (Insulin-like Growth Factor I) impliqués dans la synthèse protéique et la régulation du glucose sanguin joue un rôle important dans le contrôle de la masse musculaire. L'IGF-I, hormone peptidique principalement synthétisée au niveau hépatique, est stimulée par l'hormone de croissance (GH). De ce fait, elle peut être utilisée comme biomarqueur de la prise de GH. L'IGF-1 circule dans le sérum lié à des protéines vectrices, les IGF-BPs. Ces dernières, du fait de leur rôle de transport, régulent au niveau systémique et local la biodisponibilité de l'IGF-1. Seule la forme libre est bioactive. Le dosage de l'IGF-1 a été particulièrement étudié et de nombreux travaux rapportent l'analyse d'IGF-1 par spectrométrie de masse. Le dosage est délicat, étant donné la grande affinité de l'IGF-1 pour les IGF-BPs. Plusieurs techniques sont utilisées pour libérer l'IGF-1 de ses protéines de liaison : extraction sur phase solide, extraction acide-alcool ou dissociation par addition d'un excès d'IGF-2. L'Agence mondiale antidopage a proposé aux différents laboratoires antidopage d'implémenter une analyse par spectrométrie de masse via une approche bottum-up qui consiste en une quantification de peptides issus de la digestion trypsique d'IGF-1. L'un des axes de la thèse aura pour but de développer et optimiser une méthode d'analyse top down et de comparer aux méthodes déjà existantes. Si un partenariat est possible avec un autre laboratoire antidopage, une étude interlaboratoire pourra être effectuée afin de vérifier la reproductibilité et la robustesse de la méthode d'analyse proposée. 2. Détection des analogues d'IGF-I Les analogues de synthèse d'IGF-1 seront également ciblés dans ces travaux. En effet, afin d'améliorer les actions physiologiques d'IGF-I, certains laboratoires ont modifié la structure primaire de l'IGF-I et synthétisé des analogues tels que Des(1-3)-IGF-I et LongR3-IGF-I, qui présentent une affinité réduite vis-à-vis des protéines de liaison présentes dans le sang. Ainsi, ces molécules présenteraient une biodisponibilté plus importante au niveau des tissus cibles. Elles sont utilisées par certains sportifs qui établissent des protocoles d'administration par injection intramusculaire. A l'heure actuelle, aucune donnée sur l'homme n'est disponible. De ce fait, une administration expérimentale d'analogues proche de celle réalisée par les sportifs sera réalisée sur un modèle murin. Des échantillons sanguins et/ou urine après administration d'analogues seront analysés pour étudier la cinétique d'élimination, déterminer la fenêtre de détection après administration et l'effet sur la performance physique. Des études in vitro (hépatocytes humains) compléteront également l'étude. Les travaux de la thèse auront pour but de développer une méthode d'analyse sensible et reproductible de ces analogues dans le sérum. Une analyse d'échantillon d'athlètes qui pratiquent un sport à risque et ayant donné leur consentement pourra être effectué. De même, si un partenariat est possible avec un autre laboratoire antidopage, une étude interlaboratoire pourra être effectuée.