Développement de méthodologies innovantes pour la caractérisation d’interfaces protéine-protéine et la conception d’inhibiteurs spécifiques : exploration de l’interface protéique de RhoA /ArhGEF1

Development of innovative methodologies for protein-protein interfaces characterization and specific inhibitor designs

• Auteur / Autrice : Ennys Gheyouche
• Direction : Bernard Offmann, Stéphane Téletchéa, Gervaise Loirand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Moléculaire et structurale, Biochimie
• Date : Soutenance le 29/01/2020
• Etablissement(s) : Nantes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Nantes)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (Nantes)
• Jury : Président / Présidente : Jacqueline Cherfils
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sophie Sacquin-Mora, Pascal Bonnet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Criblage pharmacologique

Hypertension artérielle

Médicaments -- Conception

Chimie -- Informatique

Mots clés libres

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Résumé

La superfamille des GTPases Ras est l’une des plus grandes familles de protéines impliquées dans la transduction du signal cellulaire, avec un total de 166 membres. Cette superfamille partage un mécanisme d'activation commun dans lequel l’hydrolyse d’un GTP en GDP arrête la signalisation cellulaire post stimulation. La GTPase peut alors être rechargée en GTP par un facteur d'échange de guanine (GEF) spécifique. Dans notre étude, nous avons cherché à comprendre au niveau moléculaire, par des approches in silico, comment p115-GEF (Arhgef-1) participait au mécanisme d'échange du nucléotide chez RhoA. RhoA joue en effet un rôle clé dans la réponse des cellules des muscles lisses vasculaires à l'angiotensine-II. Notre approche a consisté à étudier par dynamique moléculaire tout atome les différentes formes libres et liées des deux partenaires protéiques, ainsi que l’influence du magnésium et du nucléotide dans ce processus. Cette étude nous a permis de déterminer les étapes clés du mécanisme d’échange du nucléotide, en précisant les acides aminés et les modifications structurales essentielles au mécanisme. En parallèle, nous avons mis en place une stratégie structure-based de criblage virtuel en analysant les changements conformationnels préalables à l’échange de nucléotide. Cette stratégie ensemble-based a permis d’identifier plusieurs ligands potentiels qui ont démontré leurs affinités et leurs spécificités in vitro. Nous avons poursuivi ce travail préliminaire d’identification de hit par une phase d’optimisation des molécules d’intérêt. Tout d’abord, une analyse combinatoire des modifications chimiques potentielles a révélé de nouveaux composés à synthétiser et tester. Ensuite, l’identification des groupements principaux jouant un rôle dans la reconnaissance de la cible protéique a permis d’identifier des composés alternatifs écartés lors de la phase préliminaire de criblage. Les molécules proposées lors de ces trois approches sont évaluées expérimentalement par les partenaires du projet. La combinaison des approches virtuelles, fondamentales et finalisées nous a permis de mieux comprendre le mécanisme d’échange du GDP pour RhoA et d’identifier des inhibiteurs spécifiques de ce mécanisme. La confirmation expérimentale de ces prédictions devrait permettre d'ouvrir la voie sur des pistes thérapeutiques solides contre l'hypertension artérielle.

Ras GTPases superfamily is one of the largest proteine families involved in cell signal transduction, with a total of 166 members. This superfamily shares a common activation mechanism in which the hydrolysis of a GTP to GDP arrests post stimulation cell signalling. The GTPase can then be reloaded in GTP by a specific guanine exchange factor (GEF). In our study, using in silico approaches, we sought to understand at the molecular level, how p115-GEF (Arhgef- 1) was involved in the nucleotide exchange mechanism in RhoA. RhoA plays a key role in the response of vascular smooth muscle cells to angiotensin II. Our approach consisted in studying by all atom molecular dynamics simulations the different free and bound forms of the two protein partners, as well as the influence of magnesium and nucleotide in this process. This study allowed us to determine the key steps of the nucleotide exchange mechanism, specifying the amino acids and structural modifications essential to the mechanism. In parallel, we have implemented a structure-based virtual screening strategy by analyzing key conformational changes prior to nucleotide exchange. This ensemblebased strategy has allowed to identify several potential ligands that have demonstrated their affinities and specificity in vitro. We have continued this preliminary work of hit identification through a phase of optimization of molecules of interest. First, a combinatorial analysis of potential chemical changes revealed new compounds to be synthesized and tested. Second, the identification of the main chemical groups playing a role in the interaction with the target made it possible to identify alternative compounds discarded during the preliminary screening phase. The molecules identified in these three approaches are experimentally evaluated. The combination of virtual, fundamental and finalized approaches has allowed us to better understand the nucleotide exchange mechanism for RhoA and to identify specific inhibitors. The experimental confirmation of these predictions should pave the way for solid therapeutic solutions for high blood pressure.