Dynamique de la chromatine et la régulation du changement du type sexuel chez la levure

Dynamics of chromatin and the regulation of sexual type change in yeast

• Auteur / Autrice : Sylvain Audibert
• Direction : Kerstin Bystricky
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 22/11/2017
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Biologie Moléculaire Eucaryote (Toulouse ; 1999-2020)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chromatine

ARN bicaténaire

Recombinaison génétique

Saccharomyces cerevisiae

Mots clés libres

Organisation du noyau

Chromatine

Recombinaison homologue

Saccharomyces cerevisiae

Nucleus organization

Chromatin

Homologous recombination

DNA repair

Résumé

La recombinaison homologue (RH) est un mécanisme de réparation des cassures d'ADN double brin (CDB) essentiel pour le maintien de l'intégrité du génome. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l'étude du "changement de type sexuel", comme modèle de recombinaison, a contribué à la compréhension des notions fondamentales de cette voie de réparation. Le changement de type sexuel implique la conversion allélique du locus MAT d'une forme "MATa" à "MATα". Ce mécanisme est initié par l'apparition d'une CDB unique induite par l'endonucléase HO au niveau du locus MAT. Les séquences homologues HMLα et HMRa, présentes sur le chromosome III, sont utilisées comme donneur lors de la réparation. L'alternance du type sexuel s'explique par le choix récurant du donneur de type sexuel opposé, assurant le changement allélique du locus MAT à chaque génération cellulaire. L'étude du choix du donneur a conduit à l'identification d'une séquence appelée le "recombination enhancer" (RE), située proche du locus HMLα sur le bras gauche du chromosome III. Dans les cellules MATa, le RE "activé" permettrait la formation d'une boucle entre la région RE et le locus MAT favorisant la recombinaison avec la séquence HMLα proche. Cependant, la formation de cette boucle sur le chromosome III et les facteurs impliqués sont encore mal caractérisés. Au cours de mes travaux de thèse, j'ai étudié l'organisation du chromosome III selon le type sexuel de la levure S. cerevisiae avant l'induction de l'endonucléase HO et des évènements de RH. Mon hypothèse de travail suggère que le RE jouerait un rôle sur l'organisation du chromosome III avant l'apparition de la CDB par HO, contribuant à l'augmentation de l'efficacité du choix du donneur lors du changement de type sexuel. Ainsi, j'ai pu mettre en évidence deux rôles distincts pour la partie gauche et droite du RE. La partie gauche du RE est impliquée dans le choix du donneur lors des évènements de RH, mais présente un effet modéré sur le repliement du chromosome III lors de sa suppression. La partie droite du RE semble indispensable pour l'organisation du chromosome III dans les deux types sexuels MATa et MATα. Ces résultats suggèrent que la modulation de l'organisation d'un chromosome via une séquence "enhancer" pourrait contribuer au choix du donneur lors de la RH. Dans un second temps, mes travaux de thèse se sont dirigés vers la compréhension des évènements de réparation d'une CDB. J'ai utilisé l'avantage du modèle de changement de type sexuel permettant d'induire une CDB unique dans le génome via l'endonucléase HO. Ainsi, cette approche m'a permis de mettre en place une étude visant à identifier les facteurs recrutés au niveau du site de réparation afin de mieux comprendre la dynamique des évènements impliqués dans la RH. En effet, la régulation précise de l'activité ainsi que l'adressage de facteurs clés de réparation au niveau de la cassure n'ont toujours pas été clairement caractérisés. Les principaux enjeux actuels demeurent dans l'identification de tous les acteurs présents au niveau d'un site de cassure unique à un instant donné. Dans ce contexte, j'ai étudié la dynamique de réparation d'une CDB en réalisant une co-immunoprécipitation des facteurs de réparation avec l'aide du système ANCHOR-FLAG inséré, proche du site de cassure MAT. Une cinétique de co-immunoprécipitation lors de l'induction de la CDB m'a permis d'étudier l'arrivée séquentielle des protéines impliquées dans la réparation. L'analyse des échantillons par spectrométrie de masse (MS) révèle plus d'une vingtaine de protéines impliquées dans la réparation. Ces résultats préliminaires sont très encourageants. Le développement de cette approche permettra de mieux caractériser la dynamique des évènements de réparation de l'ADN par RH. Le système ChIP-MS, via ANCHOR, permet pour la première fois une analyse du protéome sur un site unique de cassure.

Homologous recombination (HR) is a DNA repair pathway dedicated to double-stranded DNA breaks (DSB) that is essential for genome integrity. In yeast Saccharomyces cerevisiae, study of the "mating type switch" as a model of HR has helped to understand several aspects of this repair pathway. The mating type switching involves the allelic conversion of the MAT locus from a "MATa" form to "MATα". This mechanism is initiated by the appearance of a single DSB induced by the HO endonuclease at the MAT locus. The DSB is then repaired by HR with one of the homologous sequences, HMLα and HMRa, present on chromosome III. The recurrent choice of the donor of the opposite sexual type ensures the allelic change of the MAT locus. Thus, the study of the directionality of donor selection allowed the identification of a sequence called the "recombination enhancer" (RE) located near the HMLα locus on the left arm of chromosome III. In MATa cells, the "activated" RE would allow the formation of a loop between the RE region and the MAT locus promoting efficient recombination with the close sequence HMLα. However, the formation of this loop on chromosome III and the factors involved are still poorly characterized. During my thesis work, I studied the organization of chromosome III according to the sexual type of yeast S. cerevisiae before the induction of HO endonuclease and HR events. My working hypothesis suggests that the RE would play a role on the organization of chromosome III before the appearance of DSB; contributing to the increased efficacy of donor selection during mating type switching. Thus, I was able to highlight two distinct roles for the left and right part of the RE. The left side of the RE is involved in donor selection during HR events but has a moderate effect on chromosome III folding when removed. The right part of the RE seems indispensable for the organization of chromosome III in both sexual types MATa and MATα. These results suggest that the modulation of chromosome organization via an enhancer sequence could contribute to donor selection in HR. In a second time, my thesis work was directed towards the understanding of the events of repair of a DSB. I used the advantage of the mating type switch model to induce a single DSB in the genome via the HO endonuclease. This approach enabled me to set up a study to identify the factors recruited at the repair site in order to better understand the dynamics of the events involved in HR. Indeed, the precise regulation of activity as well as the addressing of key repair factors at the fracture level have still not been clearly characterized. The main current challenges remain in the identification of all the players present at a single DSB site at a given moment. In this context I studied the repair dynamics of a DSB by co-immunoprecipitating the repair factors with the help of the ANCHOR-FLAG system inserted near the MAT fracture site. Co-immunoprecipitation kinetics during DSB induction allowed me to study the sequential arrival of proteins involved in repair. Analysis of the samples by mass spectrometry reveals more than twenty proteins involved in the repair. These preliminary results are very encouraging. The development of this approach will better characterize the dynamics of DNA repair events by HR. The ChIP-MS system via ANCHOR allows for the first time a proteome analysis on a single break site.