Développement d'un système intégré et portable d'amplification et de détection d'ADN basé sur une agrégation électrohydrodynamique

Development of an integrated, portable DNA amplification and detection system based on electrohydrodynamic aggregation

• Auteur / Autrice : Bastien Venzac
• Direction : Laurent Malaquin, Jean-Louis Viovy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microfluidique - Biotechnologies
• Date : Soutenance le 07/12/2016
• Etablissement(s) : Paris 6
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physique en Île-de-France (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physico-chimie Curie (Paris ; 1996-....)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Olivia Du Roure
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Mats Nilsson, Jan Eijkel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biotechnologie

ADN bactérien

Microfluidique

Mots clés libres

Microfluidique

ADN

Détection

HRCA

Intégration

Instabilités électro-hydrodynamiques

DNA detection

Microfluidics

HRCA

Résumé

Cette thèse présente le développement d'une nouvelle méthode de détection portable d'ADN bactérien. Une solution concentrée de longs ADNs forme des agrégats lorsqu'elle est soumise à un fort champ électrique dans un microcanal, qui sont détectables par conductimétrie. Après optimisation, un instrument portable incluant un système microfluidique et un module électronique compact pour le contrôle des champs électriques a été obtenu. Pour la détection de biomarqueurs usuels, une amplification isotherme d'ADN appelée HRCA a été testé de façon à allonger puis amplifier ces courts ADN en longs produits. Des expériences en temps-réel, une simulation de la cinétique d'amplification et une modélisation théorique ont permis la caractérisation de la réaction et de conclure que la plupart des produits générés en solution sont de petites tailles. Une réaction en deux étapes combinant une SDA et une RCA a finalement été développée pour amplifier, allonger puis détecter 10pM de séquences d'ADN issues de Staphylococcus Aureus. L'intégration sur puce d'une étape de traitement de l'échantillon et de la réaction d'amplification a nécessité le développement d'une nouvelle technologie nommée "murs mobiles". Ces structures 3D, contenant des microcanaux ou des membranes en hydrogel, peuvent être déplacées manuellement à l'intérieur de microsystèmes pour diverses applications: valves, séparation de chambres microfluidiques, préconcentration de molécules ou pour le développement de puces microfluidiques reconfigurables.

This thesis presents the development of a new portable detection method for bacteria. When subjected to a high electric field in a confined microchannel, a concentrated solution of long DNA formed large aggregates, detectable by conductometry. A previous prototype has been optimized to obtain a portable and label-free instrument including a microfluidic system and a compact electronic for the control of the electric field. To apply this technique to current DNA biomarkers, an isothermal amplification reaction called Hyper-branched Rolling-Circle Amplification (HRCA) was tested in order to simultaneously elongate and amplify short DNAs into long products. Real-time experiments, kinetic simulations and theoretical approaches were used to characterize and model this reaction, leading to the conclusion that most of the products generated in solution are small DNAs. A two-step amplification combining a Strand-Displacement Amplification (SDA) and a RCA was finally developed to amplify then elongate DNA sequences from Staphylococcus Aureus, with a LOD of 1pM. Preconcentration of DNA and addition of reagents for sequential reactions into a microreactor were necessary to integrate pre-detection steps into a portable system. A new toolbox, called "sliding wall" was developed for these needs. Elongated microfabricated structures containing channels or hydrogel membranes could be manually displaced into a closed microchip, enabling compartmentalization, valving, molecule trapping and reconfiguration of a channel network.