Analyse comparative des performances diagnostiques et pronostiques de sous-familles d'auto-anticorps associés à la polyarthrite rhumatoïde, dirigés contre divers épitopes immunodominants de la fibrine citrullinée et analyse de leurs réactivités croisées

Comparative analysis of the diagnostic and prognostic performances of rheumatoid arthritis associated subfamilies of autoantibodies directed to immunodominant epitopes of citrullinated fibrin and analysis of their cross-reactivity

• Auteur / Autrice : Martin Cornillet
• Direction : Guy Serre, Maria Leonor Nogueira
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance en 2014
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Anticorps antipeptides cycliques citrullinés

Autoanticorps

Polyarthrite rhumatoïde

Mots clés libres

Polyarthrite rhumatoïde

Auto-anticorps

Acpa

Peptide citrulliné

Lymphocyte B

Autoimmunité

Résumé

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune caractérisée par une inflammation chronique des articulations synoviales qui peut aboutir à une érosion ostéo-cartilagineuse douloureuse et handicapante. Des facteurs génétiques et environnementaux et surtout des auto-anticorps, facteurs rhumatoïdes et auto-anticorps anti-protéines citrullinées (ACPA) sont associés à la PR. Les ACPA ciblent des antigènes porteurs de résidus citrullyl et en particulier, la fibrine citrullinée, auto-antigène majeur dans le tissu synovial. Ils sont très spécifiques de la maladie, apparaissent avant les signes cliniques et sont associés aux formes les plus sévères. Ils sont détectés dans le sérum des patients par des tests immuno-enzymatiques (ELISA) développés avec divers peptides/protéines citrullinés : avec le fibrinogène humain citrulliné sont détectés les AhFibA (anti-human citrullinated fibrinogen autoantibodies). Une cartographie épitopique de la fibrine citrullinée a permis d'identifier deux peptides, a36-50Cit38,42 et ß60-74Cit60,72,74, comme porteurs des épitopes immuno-dominants. L'objectif de ce travail était de caractériser ces épitopes, de développer des tests permettant de détecter spécifiquement les sous-familles d'AhFibA ciblant ces épitopes, d'évaluer la valeur diagnostique et pronostique de chaque sous-famille et d'analyser leur spécificité antigénique fine, comparativement à celle d'autres ACPA. Nous avons d'abord identifié les épitopes reconnus par les AhFibA sur a36-50Cit38,42 (a : VECit42HQ et a' : Cit38VVE) et ß60-74Cit60,72,74 (GYCit72ACit74) en utilisant de courts peptides synthétiques chevauchants (MultipinTM). Ensuite, à l'aide de constructions peptidiques originales, nous avons développé et optimisé diverses méthodes d'ELISA qui ont permis d'évaluer l'impact de la longueur et du mode de fixation des peptides (adsorption passive vs avidine-biotine), ainsi que celui de la distance entre épitope-cible et support, sur le titre et les index diagnostiques des auto-anticorps détectés. Le paramètre majeur dans la capacité d'un peptide à être reconnu par les sérums a été la distance entre épitope et biotine, indépendamment de la longueur du peptide et que celle-ci soit C- ou N-terminale. Par ailleurs a été confirmée la valeur diagnostique du peptide ß60-74Cit60,72,74 qui, sous forme biotinylée en N-terminal présente des performances égales à celles des AhFibA. A l'aide d'une une cohorte toulousaine de patients atteints de maladies rhumatologiques anciennes comportant 76% de PR AhFibA-positives (à la spécificité de 98,5%), nous avons montré que 41% des PR avaient des anti-a36-50Cit38,42 et 62 % des anti-ß60-74Cit60,72,74, plus de 90% des patients possédant l'un ou l'autre de ces anticorps. Des tests d'inhibition croisée ont permis de montrer qu'anti-a36-50Cit38,42 et anti-ß60-74Cit60,72,74 constituaient deux sous-familles d'auto-anticorps différentes. Nous avons également montré avec une cohorte camerounaise de PR anciennes, que la sensibilité diagnostique des AhFibA (73%), la proportion d'anti-a36-50Cit38,42 (45%) et celle d'anti-ß60-74Cit60,72,74 (73%) étaient similaires à celles de la cohorte toulousaine. Les caractéristiques des AhFibA dans la PR sont donc similaires chez les Noirs Africains et chez les Caucasiens montrant que cette réponse immune B liée à la maladie est largement indifférente aux facteurs génétiques et environnementaux. Parallèlement, à partir d'une cohorte française multicentrique de PR débutantes (ESPOIR), nous avons confirmé que les performances diagnostiques des AhFibA étaient similaires à celles des tests de références (anti-CCP2, anti-MCV) et nous avons montré que les proportions de sérums AhFibA-positifs contenant des anti-a36-50Cit38,42 et/ou anti-ß60-74Cit60,72,74 étaient similaires à celles des sérums de PR établies, révélant ainsi que la composition des AhFibA est homogène et indépendante du stade d'évolution de la maladie. A l'aide de la cohorte ESPOIR, nous avons aussi évalué les valeurs pronostiques des deux sous-familles d'anticorps, en analysant divers paramètres cliniques et radiologiques à trois ans d'évolution de la maladie. Les patients qui présentaient des auto-anticorps (AhFibA, anti-a36-50Cit38,42 ou anti-ß60-74Cit60,72,74) au moment du diagnostic, ont eu une érosion articulaire médiane deux fois plus rapide que les patients qui n'en avaient pas. Les AhFibA sont donc des marqueurs de mauvais pronostic et ce, quelle que soit leur spécificité fine. Sous-familles et AhFibA (présence/absence ou titre) sont associés de façon similaire avec les allèles HLA-DR de susceptibilité à la PR mais ne le sont pas avec le tabagisme. De nombreux autres peptides-cibles des ACPA ont été décrits mais leurs réactivités croisées avec les ACPA sont encore mal caractérisées. Nous avons développé un ELISA avec l'un de ces peptides citrullinés (EBNA35-58Cit) dérivé d'une protéine du virus Epstein-Barr (EBV). Nous avons montré que les patients atteints de PR qui sont EBNA35-58Cit-positifs (36% de 181 PR) constituent un sous-groupe des patients AhFibA-positifs et, par des expériences d'inhibition, que les anticorps anti-EBNA35-58Cit présentent une très forte réactivité croisée avec le peptide ß60-74Cit60,72,74. Ce résultat renforce l'hypothèse d'une implication du virus dans la physiopathologie de la PR. En conclusion, notre travail a contribué à la caractérisation des AhFibA en montrant qu'ils étaient principalement constitués de deux sous-familles d'auto-anticorps différentes dont l'une présente une forte réactivité croisée avec un peptide dérivé d'EBV. Les AhFibA et leurs sous-familles sont présentes dans les mêmes proportions chez les Caucasiens et chez les Noirs Africains, et que la PR soit établie ou débutante. L'hétérogénéité des résultats des multiples tests ELISA que nous avons développés à partir de divers peptides porteurs des mêmes épitopes immuno-dominants, montrent que toute comparaison de données publiées concernant la spécificité fine des ACPA doit être abordée avec la plus grande circonspection.

Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease characterized by chronic inflammation of synovial joints often leading to painful and disabling join erosion. Genetic and environmental factors and, above all autoantibodies, rheumatoid factor and anti-citrullinated proteins autoantibodies (ACPA), are associated with RA. ACPA recognize antigens containing Citrullyl residues and particularly citrullinated fibrin, the major autoantigen in synovial tissues. They are highly specific of the disease, appear years before clinical onset and are associated with the more severe forms. ACPA can be assayed in sera by ELISAs developed with various citrullinated peptides/proteins, for example citrullinated human fibrinogen allowing the detection of anti-human citrullinated fibrinogen autoantibodies (AhFibA). An epitope mapping of citrullinated fibrin led to the identification of two peptides a36-50Cit38,42 and ß60-74Cit60,72,74 as bearing its immunodominant epitopes. The aim of the present work was to characterize those epitopes, to develop ELISAs that will specifically detect subfamilies of AhFibA directed to each epitope, to evaluate the diagnostic and prognostic value of each subfamily and to analyze their fine specificity comparatively to those of other ACPA. We first identified the epitopes recognized by AhFibA on a36-50Cit38,42 (a : VECit42HQ et a' : Cit38VVE) and ß60-74Cit60, 72,74 (GYCit72ACit74) using short overlapping synthetic peptides (MultipinTM). Then, with original peptide constructs we developed and optimized several ELISAs that allowed evaluating the impact of the length and the method of binding of peptides (passive adsorption vs avidin-biotin) as well as that of the distance between the targeted epitope and the solid phase, on the titres and the diagnostic indexes of the detected autoantibodies. The major parameter influencing the ability of a peptide to be recognized by sera was the distance between the epitope and the biotin, irrespective of the peptide length and the biotin position (C- or N-terminal). Besides, we confirmed the diagnostic value of the ß60-74Cit60,72,74 peptide that in a N-terminal biotinylated form presented diagnostic performances similar to those of AhFibA. With a cohort from Toulouse composed of patients with established rheumatic diseases, 76% of RA patients being AhFibA-positive (specificity 98. 5%), we found that 41% of RA patients had anti-a36-50Cit38,42 and 62% anti-ß60-74Cit60,72,74 autoantibodies, 90% having one or both subfamilies of autoantibodies. Cross-inhibition experiments allowed demonstrating that anti-a36-50Cit38,42 and anti-ß60-74Cit60,72,74 constitute two different subfamilies of autoantibodies. We also showed, with a cohort of patients with established rheumatic diseases from Cameroon, that the diagnostic sensitivity of AhFibA (73%), the proportion of anti-a36-50Cit38,42 (45 %) and that of anti-ß60-74Cit60,72,74 (73%) were similar to those of the cohort from Toulouse. The AhFibA hallmarks in RA are thus identical in Black Africans and in Caucasians demonstrating that this RA-associated B-cell immune response is largely independent of environmental and genetic factors. In addition, using a French multicenter cohort of patients with early RA (ESPOIR) we confirmed that the diagnostic performance of AhFibA were similar to those of the reference tests (anti-CCP2, anti-MCV), and we showed that the proportions of AhFibA-positive sera containing anti-a36-50Cit38,42 and/or anti-ß60-74Cit60,72,74 were similar to those of established RA, revealing that AhFibA composition was homogeneous and independent of the disease stage. With the same cohort, we also assessed the prognostic value of the two autoantibody subfamilies, analyzing clinical and radiological parameters after three years of disease progression. Patients who had autoantibodies (AhFibA, anti-a36-50Cit38,42 or anti-ß60-74Cit60,72,74) at the time of the diagnosis, had a median variation of joint erosion, two times higher than those who did not. Thus, AhFibA are markers of poor prognosis regardless of their fine specificity. AhFibA and their subfamilies (presence/absence and titre) were also similarly associated with the HLA-DR susceptibility alleles but not with tobacco exposure. Other peptides have been described as ACPA targets, however their level of cross-reactivity with ACPA are not still well characterized. We developed an ELISA with one of those citrullinated peptide (EBNA35-58Cit) derived from a protein of the Epstein-Barr virus. We demonstrated that EBNA35-58Cit-positive RA patients (36% of 181 RA) constituted a subgroup of AhFibA-positive patients and, through cross-inhibition experiments, that anti-EBNA35-58Cit antibodies strongly cross-reacted with ß60-74Cit60,72,74. This result reinforces the hypothesis of a role for the virus in the pathophysiology of RA. In conclusion, our work contributed to characterize AhFibA demonstrating that they are mainly composed of two different subfamilies of autoantibodies, among which one strongly cross-react with a peptide derived from EBV. AhFibA and their subfamilies are present in the same proportions regardless of the disease stage (recent or established RA) and similarly in Caucasians and in Black Africans. Heterogeneity of the results obtained with ELISAs developed with various peptides bearing the same immunodominant epitopes show that the published data about ACPA fine specificity must be analyzed with extreme caution.