Rôle des phosphatases acides dans le métabolisme et le stockage des sucres dans la vacuole chez Arabidopsis thaliana : approches in vitro et in silico

• Auteur / Autrice : Antoine Monier
• Direction : Bertrand Beauvoit
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie végétale
• Date : Soutenance le 13/12/2012
• Etablissement(s) : Bordeaux 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie du fruit et pathologie
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Fabien Letisse, Jean-Pierre Mazat
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Rémi Lemoine, Marie-Pascale Prud’homme

Mots clés

Mots clés contrôlés

Métabolites

Phosphatases

Vacuoles

Arabidopsis thaliana

Mots clés libres

Arabidopsis

Vacuole

G6p

Purple Acid phosphatase

Marquage

Flux

Modélisation

Copasi

Arabidopsis

Vacuol

G6p

Purple Acid phosphatase

Labelling

Rate

Modeling

Copasi

Résumé

Les « Purple Acid Phosphatases » (PAPs) sont des phosphatases acides présentes dans le règne végétal et animal. Elles sont caractérisées à la fois par la présence de sept acides aminés conservés impliqués dans la structure d’un centre bimétallique et par leur couleur rose/violète lorsqu’elles se trouvent en solution. Chez les plantes, certaines PAPs présenteraient à la fois une activité phosphatase sur des métabolites (PEP, G6P…) et sur des phospho-peptides (glycosidases…), d’une part, et une activité peroxydase, de l’autre. Ces PAPs pourraient donc, non seulement être impliquées dans le métabolisme carboné, mais aussi dans la détoxication des espèces réactives de l’oxygène. On compte à ce jour 29 gènes codant pour des PAPs chez Arabidopsis thaliana , dont un certain nombre est induit par la carence en Pi et par le stress oxydatif ou la senescence. Parmi eux, le gène de l’AtPAP26 (At5g34850) présente de très fortes homologies de séquence avec des orthologues présents chez d’autres plantes. La protéine AtPAP26, qui présente in vitro une activité phosphatase sur le PEP et le G6P et une activité peroxydase, est sécrétée même si de nombreux indices laissent penser qu’elle pourrait également être localisée dans la vacuole.Notre objectif est d’étudier le rôle d’AtPAP26 dans le métabolisme et le stockage des sucres dans la vacuole. Notre hypothèse de départ est que la protéine AtPAP26 pourrait intervenir via son activité phosphatase dans un cycle de substrat vacuolaire impliquant le glucose-6-phosphate et le glucose. Nous avons montré que chez le mutant pap26, l’activité glucose-6-phosphatase, mesurée in vitro et in organello, chute de manière importante. Parallèlement, chez le mutant gpt2, le transport tonoplastique des hexoses phosphates diminue de façon significative. Des expériences de marquages isotopiques sur du tissu racinaire en culture ont montré qu’une part importante du glucose et du fructose ne provient pas de l’hydrolyse du saccharose et que AtPAP26 est en partie responsable de cette synthèse. Enfin, par une approche in-silico, nous avons modélisé le métabolisme des sucres dans un système compartimenté impliquant la vacuole et ses transporteurs. La confrontation du modèle avec deux jeux de données expérimentales (concentrations à l’état stationnaire et cinétiques de marquage) a permis de confirmer l’existence d’une activité hydrolytique sur les hexoses phosphates vacuolaires.

«Purple Acid Phosphatases» (PAPs) are acid phosphatases found both in animal and vegetal kingdoms. They are characterized by the presence of seven conserved amino acids involved in a di-metal center and by their pink/purple color in solution. In plants, some PAPs exhibit an acid phosphatase activity on various phospho-esters and on phospho-peptides. An alcalin peroxidase activity has been demonstrated in vitro. Therefore, PAPs could be implicated both in the carbon metabolism and in the scavenging of reactive oxygen species. To date, 29 different PAP-encoding genes were identified in the Arabidopsis thaliana genome. Some of them are induced by phosphate deprivation, oxidative burst or senescence. The gene encoding the protein AtPAP26 (At5g34850) exhibits a high sequence similarity with orthologous from other plants. The AtPAP26 protein, showing both a phosphatase activity on PEP, G6P and F6P, and a peroxidase activity, is one of the most abundant root-secreted acid phosphatases but also appears to be localized in the vacuole. Our aim is to study the implication of AtPAP26 in the metabolism and storage of sugars in the vacuole. Our first hypothesis is that AtPAP26, via its phosphatase activity, could be involved in a glucose / glucose-6-phosphate cycle localized in the vacuole. We showed that the glucose-6-phosphatase activity in the pap26 mutant is highly affected both in vitro and in organello compared to the wild type. At the same time, the hexose phosphate transport capacity of the vacuole is highly affected in the gpt2 mutant compared to the wild-type. Moreover, isotopic labeling experiments performed on cultured root tissues have shown that a significant part of the intracellular glucose and fructose pool does not originate from sucrose and that AtPAP26 is, at least in part, responsible for this synthesis. Finally, we build a kinetic model of sugar metabolism in a compartmented system which has been validated by using two independent experimental data sets (steady state concentrations and kinetics of labeling of soluble sugars). This in silico modeling approach confirmed the involvement of a hexose phosphatase activity localized in the vacuole.