Screening and characterization of rock phosphate solubilizing Actinomycetes from Moroccan phosphate mines

Criblage et caractérisation de souches de bactéries Actinomycétales solubilisatrices du phosphate naturel isolées à partir des gisements de phosphate marocains

• Auteur / Autrice : Hanane Hamdali
• Direction : Marie-Joëlle Virolle, Yedir Ouhdouch
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques. Microbiologie
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Paris 11 en cotutelle avec Marrakech, Faculté des sciences Semlalia
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lutte biologique contre les nuisibles

Physiologie

Solubilisation

Phosphates -- Gisements

Actinomycètes

Mots clés libres

Criblage

Résumé

L’objectif de mon travail de thèse était d’explorer la capacité des souches d’Actinomycètes issues des mines de phosphate marocaines (souches MPM) à solubiliser le Phosphate Naturel (PN, hydroxyapatite) et à limiter la croissance de certains champignons phytopathogènes du sol (Pythium ultimum) afin d’utiliser ces souches pour le développement de nouvelles pratiques agricoles moins polluantes que les pratiques actuelles. Ainsi, 55 isolats (18. 3%) parmi les 300 isolats MPM testés se sont avérés capables de croître sur un milieu minimum synthétique (SMM) contenant le PN insoluble comme seule source de phosphate (P). Huit souches dont la croissance était la plus active ont été retenues. La capacité de ces 8 souches à solubiliser le PN a ensuite été suivie par des dosages de P soluble dans le milieu SMM liquide et comparée à celle de deux souches de référence Streptomyces lividans et Streptomyces griseus M1323. Une forte hausse de la concentration en P soluble a été observée dans les surnageants des souches issues des MPM et de S. Griseus M1323, mais pas dans ceux des cultures de S. Lividans. Cette augmentation de la concentration de P dans le surnageant de culture des MPM a été corrélée avec la présence de substances, absorbant à 320 nm et à 430 nm. Ces substances ont été purifiées et il a été confirmé qu’elles sont impliquées dans le mécanisme de solubilisation du PN. Elles ont par ailleurs une forte activité antibiotique et anti-fongique. Ces substances sont des sidérophores de type catécholate (appelé Viridomycin G). Ce sont des chélateurs forts du calcium qui détruisent les liens existant entre le calcium et le phosphate du PN, permettant ainsi la libération du phosphate. Elles sont produites quand la quantité de P soluble présente dans le milieu de culture est très faible. Nous avons par ailleurs montré que les souches MPM avaient une aptitude endophytique et avaient une forte capacité de stockage du glucose et du phosphate sous forme notamment de glycogène et polyphosphate. Ces souches produisaient moins de biomasse que la souche de référence S. Lividans, mais avaient une plus grande capacité de survie que cette dernière dans des conditions de forte limitation en P soluble (SMM + PN). Toutes ces caractéristiques sont importantes pour une survie de la souche à long terme dans le sol. Par ailleurs, certaines de ces souches étaient également capables de limiter, en conditions de laboratoire, la croissance de Pythium ultimum, principal agent de la fonte de semis des céréales. Cette aptitude est vraisemblablement liée à la capacité démontrée de ces souches à produire des substances antifongiques, des chitinases, des sidérophores et de l’Acide Indol Acétique. Par la suite, nous avons testé l’efficacité agronomique de ces souches et démontré que certaines avaient la capacité à stimuler la croissance d’une plante test (le blé dur) dans un modèle rhizosphérique constitué d’un sol riche en PN, d’une souche solubilisatrice du PN et de la plante, dans une expérience sous serre. Il s’est avéré que la seule présence des souches d’Actinomycètes dans le sol utilisé stimulait la croissance de la plante suggérant que ces souches étaient capables de mobiliser, pour la plante, le phosphate naturellement présent sous forme insoluble dans le sol. La présence conjointe dans ce sol des souches d’Actinomycètes et du PN pulvérisé stimulait la croissance de la plante, et en particulier celle de son système racinaire, de façon comparable à l’addition d’engrais phosphaté soluble. De même, ces souches avaient une capacité de protection, contre les effets dévastateurs de Pythium ultimum, comparable à celle du Mycostop®, produit de biocontrôle antifongique commercialisé et constitué de spores de Streptomyces griseoviridis K61. Cette étude a démontré que les Actinomycètes du sol contribuent grandement à la nutrition et donc à la croissance des plantes ainsi qu’à leur santé. Cette étude pourrait conduire à la conception/formulation et mise sur le marché de nouveaux produits ayant une activité de bio-engrais phosphaté et bio-fongicide, constitué des souches d’Actinomycètes add hoc associées ou non à du PN pulvérisé.

The aim of this work was to explore the abilities of Actinomycetes strains originating from the Moroccan phosphate mines (MPM strains) to solubilize natural phosphate (NP, hydroxyapatite) and to limit the growth of some soil-born phytopathogen fungi (Pythium ultimum) in order to use these strains for the development of novel agricultural practices less polluting than the actual ones. Fifty five isolates (18. 3%) among the 300 MPM isolates tested were able to grow on a minimal synthetic medium (SMM) containing insoluble NP as sole phosphate (P) source, suggesting that they were able to use the P trapped in the NP for their own growth. Eight strains whose growth was the most active were selected. The efficiency of these strains to solubilize NP was assessed by assaying soluble P in the growth medium and was compared to that of two reference strains Streptomyces lividans and Streptomyces griseus M1323. A sharp increase in the concentration of soluble P was observed in the cultures supernatants of the MPM strains and of S. Griseus M1323, but non in those of S. Lividans. This increase in the P concentration correlated with the presence of substances absorbing at 320 nm and 430 nm. These substances were purified and I confirmed that these substances, that had also strong antibiotic and anti-fungi activities, were involved in the NP solubilisation process. They are siderophores of the catecholate family (called Viridomycin G) acting as strong calcium chelators destroying the links between calcium and P in the NP and thus allowing the release of P. They were excreted when the concentration of P in the growth medium was really weak. I have also shown that these strains have the abilities to colonize the plant root system (endophytic property) and have very high glucose and phosphate storage abilities, (accumulating glycogen and polyphosphate) compared to the reference strain S. Lividans. These strains produce less biomass but survive better than the latter in condition of very low soluble P availability (SMM + NP). All together, these characteristics are very important for the long term survival of these bacteria in the soil. Furthermore, some of these strains were also able to limit the development, in laboratory conditions, of Pythium ultimum, the main agent of damping off of cereals. This property is likely to be linked to the demonstrated ability of these strains to excrete anti-fungal substances, chitinases, siderophores and Indol Acetic Acid. Subsequently, I have tested the agronomic efficiency of these strains and demonstrated that they had the ability to stimulate wheat plant growth in a rhizospheric model constituted by a soil rich in insoluble P, a NP solubilising strain and the plant, in greenhouse experiments. I demonstrated that the presence of a MPM Actinomycetes strain, on its own, was stimulating wheat plant growth suggesting that this strain was able to mobilize for the plant good, the insoluble P naturally present in the soil. The joined presence in this soil of the Actinomycetes strain and of the pulverised NP was stimulating wheat plant growth (specially roots growth) at a level comparable (only 10% lower) to that achieved by the addition of soluble phosphate amendment. Furthermore, these strains had the ability to protect the plant against the devastating effects of Pythium ultimum, at a level comparable (only 14% lower) to that achieved by Mycostop®, a commercial antifungal biocontrol product constituted by spores of Streptomyces griseoviridis K61. This study demonstrated that the soil-born filamentous and sporulating Actinomycetes greatly contribute to the feeding and the fitness of the plants and can be of great value for agriculture. This study is expected to lead to the conception/formulation and commercialization of novel bio-phosphate fertilizers and bio-fungicides constituted by the ad hoc Actinomycetes strains associated or not to pulverize NP. The availability of such products could contribute to the development of a sustainable agriculture more respectful of the environment and of human health than the today agriculture.