Amélioration de l'activité et de l'énantiosélectivité de la lipase Lip2 de Yarrowia lipolityca vis-à-vis des acides 2-Bromo-Aryl-Acétique

• Auteur / Autrice : Miguel Angel Cancino Cardenas
• Direction : Alain Marty
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie et biocatalyse industrielles
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA

Mots clés

Mots clés contrôlés

Criblage pharmacologique

Mutagénèse dirigée

Yarrowia lipolytica

Lipases

Mots clés libres

Ingénierie rationnelle

Mutagénèse de saturation

Criblage à haaut débit

Enantiosélectivité

Modélisation moléculaire

Résumé

La lipase Lip2 de la levure Yarrowia lipolytica a été démontrée être un catalyseur efficace pour le dédoublement de mélanges racémiques d’acides 2-bromo aryl acétique, une famille importante d’intermédiaires dans l’industrie pharmaceutique. La valeur de l’énantiosélectivité de cette enzyme vis-à-vis du mélange racémique d’acide 2-bromo-p-tolyl acétique est de 28, valeur identique à la l’enzyme la plus performante, la lipase de Burkholderia cepacia. Mais surtout, c’est la seule enzyme capable de dédoubler le mélange racémique d’acide 2-bromo-o-tolyl acétique (précurseur d’un analgésique) (E = 27). L’énantiosélectivité de cette lipase a été améliorée par mutagénèse dirigée ciblée vers le site actif. En absence de structure cristallographique, la structure tri-dimensionnelle de Lip2 a été modélisée par homologie de structure avec les lipases de Rhizomucor miehei et Thermomyces lanuginosa. A l’aide de ce modèle structural, cinq acides aminés, formant le site actif, ont été ciblés (T88, V94, D97, V232, V285). Deux résidus, en position 232 et 97, se sont avérés cruciaux pour la discrimination des deux mélanges racémiques testés, les esters éthyliques d’acides 2-bromo phényl acétique et 2-bromo-o-tolyl acétique. Le variant V232A, avec une seule mutation, conduit à une amélioration de l’énantiosélectivité d’un ordre de grandeur (E augmentée de 3 à 77 pour le dédoublement de l’ester éthylique d’acide 2-bromo phényl acétique et de 16 à 92 pour le dédoublement de l’ester éthylique d’acide 2-bromo-o-tolyl acétique). En plus de ce gain en énantiosélectivité, ce variant présente un pouvoir catalytique remarquablement augmenté (5 et 13 fois pour les esters d’acides 2-bromo-phényl acétique et -o-tolyl acétique, respectivement). En effet, l’amélioration de l’énantiosélectivité est le fruit d’une augmentation importante de la catalyse de l’énantiomère préféré, le S. Deux autres variants, V232L et 97A, présentent une énantiopréférence inversée. Tous les variants possibles aux positions 232 et 97 ont été construits par mutagénèse de saturation et mutagénèse dirigée. Un variant aux propriétés améliorées a par cette méthode été obtenu, le variant V232S. Son énantiosélectivité est supérieure à 200, avec une énantiopréférence S pour les deux mélanges racémiques étudiés. Son activité est 23 % plus élevée que celle obtenue avec le variant V232A. De nombreux variants présentent une énantiosélectivité inversée : V232 Y, L, I et F, D97A, V et S. Cependant, aucun d’entre eux n’est suffisamment actif et sélectif. Le double variant 232F97A a été construit. Ce variant présente des potentialités améliorées comparées à chacun des mono variants, avec une sélectivité totale vis-à-vis de l’énantiomère R et une activité élevée

Lip2 lipase from Yarrowia lipolytica was shown to be an efficient catalyst for the resolution of 2-bromo-arylacetic acid esters, an important class of chemical intermediates in the pharmaceutical industry. A 28 S enantiopreference versus the racemic mixture of 2-bromo-p-tolylacetic acid ethyl ester was obtained. Moreover, it is the only enzyme able to catalyze the resolution of 2-bromo-o-tolylacetic acid ethyl ester (E = 27). The enantioselectivity of this lipase was improved by site-directed mutagenesis targeted at the substrate binding site. To guide such mutagenesis experiments, the three-dimensional structure of this lipase was modeled by homology modelling using as templates the structures of lipases from Rhizomucor miehei and Thermomyces lanuginosa. On the basis of this structural model, five amino acid residues (T88, V94, D97, V232, V285) forming the hydrophobic substrate binding site of the lipase were selected for site-directed mutagenesis. Two key residues (232 and 97) were identified for the discrimination of two racemates of pharmaceutical interest, namely 2-bromo phenyl and o-tolyl acid esters. One variant of the enzyme containing one single amino acid change (V232A) displayed an enantioselectivity enhanced by one order of magnitude (E-value increased from 3 to 77 for the resolution of 2-bromo-phenylacetic acid ethyl ester by wild-type and V232A, respectively and from 16 to 92 for the resolution of 2-bromo-o-tolylacetic acid ethyl ester, a precursor for analgesics). In addition to the gain in enantioselectivity, a remarkable increase in velocity was observed (5- and 13-fold increase for 2-bromo-phenylacetic and -o-tolylacetic acid ethyl esters, respectively). Such an improvement in enantioselectivity results from a gain in reactivity of the favoured enantiomer. Other variants, V232L and 97A displayed a reversed enantiopreference. In order to more deeply investigate the role of a specific residue at both crucial positions 97 and 232, the construction of all variants possible was realized. This strategy enables a better variant, V232S, to be obtained. Its enantioselectivity is higher than 200 for both racemic mixture with a S enantiopreference and its activity is 23 % higher than the one obtained with the variant V232A. Many variants present a reverse enantioselectivity: V232 Y, L, I and F, D97A, V and S. Nonetheless, none of them was sufficiently both active and enantioselective. The double variant 232F97A was then built. This variant presents enhanced potentialities compared to each mono variant a total selectivity for the R enantiomer with a high activity