Nouveaux outils pour la coupure et la détection d'ADN

New tools for cleavage and detection of DNA

• Auteur / Autrice : Philippe Simon
• Direction : Jean-Luc Décout, Marc Fontecave
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Grenoble 1

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chimie bioorganique

Électrochimie

ADN

Résumé

Ce travail porte sur la synthèse et l'étude des propriétés de nouveaux dérivés flaviniques, constitués par un dérivé de flavine conjugué à une chaîne de type nucléotidique ou nucléopeptidique (PNA). Un des objectifs de ce travail était de déterminer si la flavine peut jouer le rôle de marqueur rédox témoin de l'hybridation entre les conjugués oligonucléotide-flavine et leurs complémentaires. Les résultats ont montré que les potentiels redox des flavines sont modifiés en présence d'un ADN cible. Cette étude a montré que les conjugués oligonucléotide-flavine peuvent être utilisés pour la détection electrochimique d'ADN. Notre travail a aussi permis de montrer que les conjugués oligonucléotide-flavine sont à la base d'un nouveau système de détection d'ADN avec amplification du signal. Ce système fait intervenir la flavine réductase d'E. Coli pour la mise en évidence de l'hybridation. L'amplification du signal est quant à elle assurée par le cycle catalytique oxydation/réduction de la flavine. Les expériences ont montré qu'il est possible de détecter environ une picomole d'ADN avec ce système. Afin d'obtenir une meilleure sensibilité, un autre système faisant intervenir un conjugué oligonucléotide inhibiteur est en cours d'étude. Un autre objectif de notre travail était la synthèse d'une nucléase artificielle faisant intervenir une enzyme et un conjugué PNA-flavine afin d'induire des coupures sur un ADN cible. La synthèse et l'étude d'un PNA-flavine ont montré que ce système est capable de recruter une enzyme présente dans le milieu intracellulaire afin d'induire des lésions spécifiques sur un ADN complémentaire in vitro. ?

The aim of this work was to synthetize and study the properties of new modified flavins constituted by a flavin moiety coupled to an oligonucleotide or a peptidic nucleic acid (PNA). In a first part we wanted to determine if the flavin moiety could be a redox sensor of hybridization between oligonucleotide-flavin conjugates and their complementary DNAs. The results showed that the redox potentials of flavins are modified when a target DNA is added. This study revealed that oligonucleotide-flavin conjugates can be used to detect DNA by electrochemistry. In this work we also developed a new system of DNA detection by signal amplification using oligonucleotide-flavin conjugates. In this system, the E coli flavin reductase was selected for its ability to discriminate between hybridized and non-hybridized probes. The signal amplification results from the favin oxidation/reduction catalytic cycle. The experiments showed that it is possible to detect about one picomole of target DNA in a sample. A new oligonucleotide-inhibitor conjugate is currently under study in order to increase sensitivity. In the last part of this work we synthetized a new artificial nuclease associating an enzyme and a PNA-flavin conjugate so as to induce cleavage on a DNA target. A PNA-flavin conjugate was prepared and studied, which showed that this system is able to recruit an intracellular enzyme to induce specific lesions on a complementary DNA in vitro.