Réactions chimiosélectives pour l'étude d'interactions biomoléculaires

• Auteur / Autrice : Jean-Michel Garcia
• Direction : Oleg Melnyk
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance en 2003
• Etablissement(s) : Lille 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines virales

Hydrazones

Oximes

Aldéhydes

Ligands

Protéines virales

Hydrazones

Aldéhydes

Ligands (biochimie)

Résumé

Le travail effectué au cours de cette thèse se situe à l’interface de plusieurs domaines : la chimie, la biologie et la technologie des biopuces à peptides. Le coeur de ce projet est basé sur la réactivité particulière des peptides a-oxo aldehydes qui sont d’excellents partenaires dans les réactions chimiosélectives de type hydrazone, semicarbazone ou oxime. Grâce à cela, le screening d’une partie de la protéine NS3 du virus de l’hépatite C, a permis de mettre en évidence des épitopes conformationnels peptidiques. Le premier chapitre constitue un prélude bibliographique sur les différents types de ligations chimiques et en particulier sur les ligations hydrazone et oxime. Les principes de la reconnaissance antigène-anticorps sont également présentés afin de mieux comprendre la problématique du criblage épitopique, ses contraintes et son application au cas de l’hépatite C. Ce travail utilise l’outil biopuce ; aussi un développement succinct de cette technologie, très centré sur notre application, est donné. Enfin, des bases de statistique sont rappelées. Dans le second chapitre, nous décrivons la mise au point et la validation d’une méthode de dosage simple et rapide des fonctions a-oxo aldéhydes via la formation d’une oxime. Dans le troisième chapitre, nous avons démontré qu’il était possible de recréer un épitope conformationnel peptidique reconnu spécifiquement par des anticorps dirigés contre la protéine NS3 du virus de l’hépatite C. Pour cela, la chimie de ligation a été employée pour connecter chimiquement des peptides issus de différentes régions distantes dans la séquence primaire de la protéine NS3 et former le motif antigénique. Dans ce chapitre, nous décrivons également les modifications que nous avons dû apporter à la technologie biopuce existante pour l’adapter à nos besoins spécifiques. Une interface bio-informatique a également dû être développée à la fois pour stocker, gérer et retraiter la masse de données générées par cette technologie. Enfin, dans le quatrième chapitre, nous exploitons le potentiel chimiosélectif de la chimie de ligation hydrazone dans une méthodologie de purification par capture covalente de peptides sur phase solide.

The work described in this manuscript takes place at the interface between several fields: chemistry, biology and peptide microarray technology. The main part of this project is based on the particular reactivity of peptide a-oxo aldehydes that are excellent partners in chemoselective reactions such as hydrazone, semicarbazone or oxime. Thanks to that, conformational epitopic peptides could be found out by screening a part of hepatitis C NS3 protein. The first chapter is an introduction to the different types of chemical ligation reactions and in particular to the hydrazone ligation. Basic antigens-antibodies recognition principles are also given for better understanding of the epitopic screening, its limits and its application to the specific case of hepatitis C virus. For this work, microarray technology was also used, and then a quick overview of this technique focused on our application is developed. Finally, basic statistical elements are reminded. In second chapter, we report the design and the validation of a new simple and quick method for the titration of a-oxo aldehyde functions via the formation of oximes. In the third chapter, we demonstrated that it was possible to build a peptidic conformational epitope recognized specifically by antibodies directed against NS3 domain of hepatitis C virus. This was achieved by using ligation to chemically bound peptides from different regions distant in the primary sequence of NS3 protein into an antigenic pattern. In that chapter, is also developed the modifications that we should have made to adapt the existing microarray technology to our specific needs. A home-made software was developped to store, manage and treat the huge amount of data generated by this technology. In fourth part, we exploited the chemoselective potential of hydrazone ligation chemistry in a new method for covalent capture purification of peptides on solid support.