Microdomaines lipidiques et régulation de la PLD du lymphocyte humain : rôle de l'acide docosahexaénoïque

Lipid microdomains and PLD regulation in human lymphocyte

• Auteur / Autrice : Olivier Diaz
• Direction : Annie-France Prigent
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance en 2003
• Etablissement(s) : Lyon, INSA

Mots clés

Mots clés contrôlés

Immunosuppression

Phospholipases

Lymphocytes

Résumé

L'acide docosahexaénoi͏̈que (DHA), un acide gras polyinsaturé de la famille n-3, a été décrit comme capable d'inhiber l'activation du lymphocyte aussi bien in vitro qu'in vivo. Cette inhibition s'accompagne d'une activation de la phospholipase D (PLD). Afin d'élucider les mécanismes mis en jeu lors de l'activation de la PLD par le DHA dans les cellules mononucléées de sang périphérique humain (PBMC), nous avons tout d'abord caractérisé les isoformes de PLD exprimées dans ces cellules ainsi que leur mode de régulation. Les PBMC expriment deux isoformes de PLD, PLD1 et PLD2, aussi bien au niveau des ARN messagers que des protéines, mais sont dépourvues de PLD oléate-sensible. L'activité PLD révélée lors de la stimulation mitogénique après enrichissement en DHA, s'est avérée indépendante des PKC, mais dépendante des petites protéines-G ARF, suggérant une implication de PLD1 principalement. Nous avons également pu mettre en évidence que PLD1 est liée à des structures particulières de la membrane, riches en cholestérol et sphingomyéline, les microdomaines lipidiques ou "rafts". PLD2 en revanche en est exclue. Après enrichissement des membranes cellulaires en DHA et stimulation par la concanavaline A, la PLD1 est délocalisée hors des "rafts", de même que certaines protéines de signalisation telles que les protéines tyrosine kinases Lck ou les protéines ARF. Le traitement des PBMC par des molécules capables de modifier le contenu membranaire des cellules en cholestérol (filipine, méthyl-b-cyclodextrine) ou en sphingomyéline (sphingomyélinase bactérienne), et donc de perturber sélectivement l'organisation des rafts, stimule fortement l'activité PLD et cette activation s'accompagne d'une délocalisation de la protéine PLD1. Parallèlement ces molécules inhibent la réponse lymphoproliférative aux mitogènes. L'ensemble de nos résultats montre que la déstabilisation partielle des microdomaines membranaires provoque la délocalisation de protéines de signalisation ainsi que de la PLD1 hors des microdomaines. La relocalisation de PLD1 dans un environnement lipidique et protéique diffèrent apparaît comme un nouveau mécanisme régulateur, de l'activation de l'enzyme. L'émission d'un signal anti-mitogénique par la PLD pourrait expliquer au moins partiellement l'effet immunosuppresseur du DHA.

The inhibition of the lymphoproliferative response by docosahexaenoic acid (DHA, 22:6 n-3) is accompanied by the activation of phospholipase D. To elucidate the mechanisms involved, we characterized the different PLD isoforms of the peripheral blood mononuclear cells (PBMC). These cells express PLD1 and PLD2, both at the m-RNA and protein levels, but they are devoid of oleate-sensitive PLD. PLD activity induced by the mitogenic stimulation of DHA-enriched cells was independent of PKC but dependent of the small G-proteins ARF, indicating that PLD1 was mainly involved. We also pointed out that PLD1 was associated to cholesterol and sphingomyelin-enriched lipid microdomains or "rafts". In contrast, PLD2 was excluded from these structures. After enrichment of the cellular membranes with DHA and stimulation, PLD1 as well as the protein tyrosine kinase Lck and ARF were delocalised out of the rafts. The treatment of cellular membranes by molecules able to modify their cholesterol or shingomyelin contents and to disturb selectively raft organization, strongly stimulated PLD activity and was accompanied by a delocalisation of the PLD1 protein. In parallel, the lymphoproliferative response to mitogenes was decreased. These results show that the partial destabilization of the rafts delocalises signalling proteins and PLD1 out of the rafts. The relocalization of the PLD1 in a different lipid and protein environment appears as a new regulatory mechanisms of PLD activation. Because PLD activation is known to convey antiproliferative signals, this could partially explain the immunosuppression effect of DHA.