Conception d'analogues structuraux d'un cyclopeptide modèle : étude du mode de reconnaissance moléculaire par trois systèmes enzymatiques membranaires

Design of structural analogues of a model cyclopeptide : study of their molecular recognition by three different membrane enzyme systems

• Auteur / Autrice : Nicolas Loiseau
• Direction : Marcel Delaforge
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance en 2002
• Etablissement(s) : Paris 11

Mots clés

Mots clés contrôlés

ATPases

Glycoprotéine P

Peptides cycliques

Mots clés libres

Tentoxine

Résumé

Les peptides cycliques suscitent un intérêt soutenu depuis plusieurs années pour deux raisons : d'une part, le contrôle de leurs structures en fait des molécules modèles idéales pour les études structures - activités de nombreux peptides linéaires ; d'autre part, les dérivés naturels de cette famille de composé présentent un large panel d'activité. Néanmoins, malgré les restrictions structurales apportées par le cycle peptidique, ce type de molécules présente un équilibre multi-conformationnel. Hors la plupart du temps, une seule conformation est responsable de l'activité pharmacologique. La tentoxine, un tétrapeptide cyclique excrété par un champignon phytopathogène de la famille Alternaria alternata, provoque la chlorose sélective de certaines plantes. Cette molécule, dont la cible protéique est l'ATPase chloroplastique, est également prise en charge par les P450 3A et la P-glycoprotéine de mammifères, protéines responsables de la transformation et de l'élimination de nombreux composés exogènes. Dans une première partie, nous décrivons l'étude de la dynamique conformationnelle de la tentoxine, ainsi que l'utilisation et le développement de méthodes de restriction conformationnelle afin de synthétiser des analogues conformationnels bloqués nous permettant de déterminer l'activité spécifique de chaque confomère. Dans une seconde partie, en utilisant une série d'analogues ainsi que des marquages spécifiques, nous avons réalisé une étude détaillée du métabolisme de ces peptides cycliques par l'isoforme hépatique humaine majoritaire : le cytochrome P450 3A4. Nous avons ainsi pu mettre en évidence la formation d'un intermédiaire métabolique carbinolamide stabilisé dans le cas de la tentoxine. Dans une troisième partie, une approche biochimique et pharmacophorique sur une série de peptides cycliques (dont fait partie la tentoxine) de taille et de structure variées, est utilisée pour étudier le site actif de la P-glycoprotéine et développer un modèle d'interaction des xénobiotiques sur cette protéine. Enfin, dans une dernière partie, nous avons comparé ces trois systèmes enzymatiques interagissant de façon identique avec la tentoxine et ses analogues structuraux. Ces différentes comparaisons nous ont permis d'élaborer des modèles des sites actifs de cers enzymes et d'effectuer des mesures de position de ces substrats dans ces modèles.

Cyclic peptides have created a sustained interest for several years for the main two following reasons: first, the possibility to control their conformations make them ideal models for structure-activity relationship studies of active linear peptides; second, natural cyclopeptide compounds show a broad range of pharmacological or cytotoxic activities. In spite of structural restrictions created by the peptide cycle, these molecules exhibit in solution a multi-conformational equilibrium in most cases. Frequently, only one conformation seems responsible for the biological activities. Tentoxin, a cyclic tetrapeptide produced by the phytopathogenic fungus Alternaria Alternata, causes host-specific chlorosis in many higher plants. The well-known enzyme target of this toxin is the chloroplast ATP-synthase, a mechanical enzyme working as a proton-driven rotatory engine, which F1 part is directly inhibited by the binding of tentoxin. In this work, we describe tentoxin as a model substrate for mammalian P450 3A and P-glycoprotein. These two membrane proteins are respectively responsible for the bio-transformation and the elimination of many exogenous compounds. In the first part of this work, we describe the conformational dynamics of the constrained ring of tertrapeptides, with special emphasis on the role of modifications such as N-methylations and dehydroresidues, that are present in tentoxin, in order to understand how to control the conformational flexibility. Molecular mechanics tools allowed us to develop new conformational restriction methods in the ring, and we synthesized more rigid conformational analogues. In such an approach, the newly designed conformational derivative allows to measure the specific activity of each natural conformer of the cyclotetrapeptide. In the second part, using the different designed or natural analogues, as well as specific radioactive tentoxin isotopomers, we studied the oxidative metabolism of cyclic peptides by the major human hepatic isoform: cytochrome P450 3A4. For tentoxin, we demonstrated the formation of a metabolic carbinolamide intermediate peculiarly stabilized. A series of cyclic peptides, including tentoxin, of various size and structure was also used to study the active site of P-glycoprotein and to develop a model of xenobiotic interaction on this protein, that explains the observed cooperativity between some of these substrates. Lastly, we built active sites models of each enzyme to describe appropriately the molecular interaction with tentoxin. No crystal structure of the three targets was available. Our models are evaluated to understand interaction of cyclopeptides with these enzymes, but also as tools to predict enzyme interactions with new drugs or pesticides.